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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接不上
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)

[求助] 连接不上 已有7人参与

我做双酶切后，再连接，就是连接不上，也找不到原因，重复了很多次，每次连接过夜后，跑电泳，有时出现三条带——双酶切的DNA和质粒，还有一条带，像是质粒的连接产物（PS：大小为质粒的两倍），有时就只有双酶切的DNA和质粒，但就是没有目的条带，请问各位，这是怎么回事儿，希望大家能帮我解答，谢谢
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1楼 2014-05-27 08:19:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:14
新手做实验，遇到失败或阴性结果，最忌不停重复。
实验结果阴性，就多做些阳性对照。阳性对照阳性，说明你的操作（或者说实验体系没有问题）。阳性对照阴性，那就说明，你的操作（或者实验体系有问题），想办法解决）。
克隆的过程很多，假设有一步酶失活了，你怎么改善你的流程，都是无效的。如果你的阳性对照充足，就能找到哪一步出了问题。
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4楼2014-05-27 11:53:46
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普通回帖

xiangyu9356

至尊木虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:17:57
连接之后最好直接转化感受态，然后涂一个对应的抗性平板，看看能不能长出克隆来。
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满堂花醉三千客，更无一人是知音。
2楼2014-05-27 09:46:14
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:06
双酶切后的两个片段要跑胶纯化后再连接效率会高些。另外，跑胶验证连接是否连接成功不合理吧。如果你的质粒上有LacZ基因的话，可以用蓝白斑筛选的方法进行验证。
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learnenglish
3楼2014-05-27 10:58:51
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:21
先把质粒分别用这两个酶切以后电泳，验证酶切位点是否正确
另外，你的目的片段是PCR产物直接双酶切还是从另外一个载体上酶切下来的呢？如果是PCR产物，建议先克隆到载体上，再进行酶切，当然，PCR产物，无论何时都要测序，确保序列正确。
连接以后没必要跑电泳，直接转化就行了，长菌鉴定。
没有阳性的话再找原因。
可以给载体片段脱磷，防止双酶切不完全，载体自连。
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5楼2014-05-27 13:25:21
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小月亮1990

铁虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:28
酶切之后要跑电泳，回收目的片段，回收后的片段，还要取出部分仔电泳，确定你能回收到目的片段，并做定量，再连接，一般片段和载体的摩尔比例：3：1~10：1，但是据我的多次连接经验，比例大一点连接效率会更好！希望能帮到你！
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加油
6楼2014-05-27 13:29:46
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小月亮1990 at 2014-05-27 13:29:46
酶切之后要跑电泳，回收目的片段，回收后的片段，还要取出部分仔电泳，确定你能回收到目的片段，并做定量，再连接，一般片段和载体的摩尔比例：3：1~10：1，但是据我的多次连接经验，比例大一点连接效率会更好！希望 ...

嗯，我酶切之后切胶纯化，再连接，但是仍然连接不上，郁闷
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7楼2014-05-27 15:16:22
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiangyu9356 at 2014-05-27 09:46:14
连接之后最好直接转化感受态，然后涂一个对应的抗性平板，看看能不能长出克隆来。

恩，我这样做过，但是送测序的时，结果失败，原因：信号太差
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8楼2014-05-27 15:17:33
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接产物转化后什么情况？

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-05-27 15:44:52
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小月亮1990

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yumupeipei at 2014-05-27 15:16:22
嗯，我酶切之后切胶纯化，再连接，但是仍然连接不上，郁闷...

纯化后有再电泳看么，要按比例连接，如果是T4 ligase ，25度 30min，就OK
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加油
10楼2014-05-27 17:01:09
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