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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接不上
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)

[求助] 连接不上 已有7人参与

我做双酶切后，再连接，就是连接不上，也找不到原因，重复了很多次，每次连接过夜后，跑电泳，有时出现三条带——双酶切的DNA和质粒，还有一条带，像是质粒的连接产物（PS：大小为质粒的两倍），有时就只有双酶切的DNA和质粒，但就是没有目的条带，请问各位，这是怎么回事儿，希望大家能帮我解答，谢谢
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1楼 2014-05-27 08:19:10
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:14
新手做实验，遇到失败或阴性结果，最忌不停重复。
实验结果阴性，就多做些阳性对照。阳性对照阳性，说明你的操作（或者说实验体系没有问题）。阳性对照阴性，那就说明，你的操作（或者实验体系有问题），想办法解决）。
克隆的过程很多，假设有一步酶失活了，你怎么改善你的流程，都是无效的。如果你的阳性对照充足，就能找到哪一步出了问题。
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4楼2014-05-27 11:53:46
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xiangyu9356

至尊木虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:17:57
连接之后最好直接转化感受态，然后涂一个对应的抗性平板，看看能不能长出克隆来。
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满堂花醉三千客，更无一人是知音。
2楼2014-05-27 09:46:14
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:06
双酶切后的两个片段要跑胶纯化后再连接效率会高些。另外，跑胶验证连接是否连接成功不合理吧。如果你的质粒上有LacZ基因的话，可以用蓝白斑筛选的方法进行验证。
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learnenglish
3楼2014-05-27 10:58:51
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:21
先把质粒分别用这两个酶切以后电泳，验证酶切位点是否正确
另外，你的目的片段是PCR产物直接双酶切还是从另外一个载体上酶切下来的呢？如果是PCR产物，建议先克隆到载体上，再进行酶切，当然，PCR产物，无论何时都要测序，确保序列正确。
连接以后没必要跑电泳，直接转化就行了，长菌鉴定。
没有阳性的话再找原因。
可以给载体片段脱磷，防止双酶切不完全，载体自连。
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5楼2014-05-27 13:25:21
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