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yumupeipei

铜虫 (小有名气)

[求助] 连接不上已有7人参与

我做双酶切后,再连接,就是连接不上,也找不到原因,重复了很多次,每次连接过夜后,跑电泳,有时出现三条带——双酶切的DNA和质粒,还有一条带,像是质粒的连接产物(PS:大小为质粒的两倍),有时就只有双酶切的DNA和质粒,但就是没有目的条带,请问各位,这是怎么回事儿,希望大家能帮我解答,谢谢
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-05-27 14:18:21
先把质粒分别用这两个酶切以后电泳,验证酶切位点是否正确
另外,你的目的片段是PCR产物直接双酶切还是从另外一个载体上酶切下来的呢?如果是PCR产物,建议先克隆到载体上,再进行酶切,当然,PCR产物,无论何时都要测序,确保序列正确。
连接以后没必要跑电泳,直接转化就行了,长菌鉴定。
没有阳性的话再找原因。
可以给载体片段脱磷,防止双酶切不完全,载体自连。
5楼2014-05-27 13:25:21
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xiangyu9356

至尊木虫 (小有名气)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-27 14:17:57
连接之后最好直接转化感受态,然后涂一个对应的抗性平板,看看能不能长出克隆来。
满堂花醉三千客,更无一人是知音。
2楼2014-05-27 09:46:14
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-27 14:18:06
双酶切后的两个片段要跑胶纯化后再连接效率会高些。另外,跑胶验证连接是否连接成功不合理吧。如果你的质粒上有LacZ基因的话,可以用蓝白斑筛选的方法进行验证。
learnenglish
3楼2014-05-27 10:58:51
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-27 14:18:14
新手做实验,遇到失败或阴性结果,最忌不停重复。
实验结果阴性,就多做些阳性对照。阳性对照阳性,说明你的操作(或者说实验体系没有问题)。阳性对照阴性,那就说明,你的操作(或者实验体系有问题),想办法解决)。
克隆的过程很多,假设有一步酶失活了,你怎么改善你的流程,都是无效的。如果你的阳性对照充足,就能找到哪一步出了问题。
4楼2014-05-27 11:53:46
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