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吉部落zy

金虫 (小有名气)

[求助] pcr之后跑琼脂糖 优化,最后要跑聚丙烯酰胺的,希望大家给个优化方向,谢谢! 已有6人参与

pcr  体系为20 ul:水  5ul
                     DNA:  5ul
                     buffer:2ul
                     dNTP:1.5ul
                    引物1::1.5
                   引物2:   1.5
                        酶:  2
前三个是降落 pcr  靠近marker的是45 退货  35个c  谢谢了   给个建议进行优化!

pcr之后跑琼脂糖 优化,最后要跑聚丙烯酰胺的,希望大家给个优化方向,谢谢!
Administrator 2014-05-17 16 小时 34 分钟.jpg
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我可以哭泣,可以悲伤,但我不可以不坚强。
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-18 17:08:50
我不知道你的DNA浓度多大,但根据经验判断,20ul体系里面加四分之一体积的模版,是不是有点太多了?
2楼2014-05-17 22:31:34
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的目的片段多大?建议减少下体系中各成分。
学习使你立于不败之地
3楼2014-05-18 11:04:48
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吉部落zy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 怎么都行 at 2014-05-17 22:31:34
我不知道你的DNA浓度多大,但根据经验判断,20ul体系里面加四分之一体积的模版,是不是有点太多了?

我是用试剂盒提的DNA   60ng/UL   前几次加2ul 几乎批不出来 ,后来试了三ul  不亮 最后加了5ul
我可以哭泣,可以悲伤,但我不可以不坚强。
4楼2014-05-18 15:33:49
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吉部落zy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-05-18 11:04:48
你的目的片段多大?建议减少下体系中各成分。

80- 250 bp之间
我可以哭泣,可以悲伤,但我不可以不坚强。
5楼2014-05-18 15:34:17
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-18 17:08:59
图中亮的位置在100bp下,也是二聚体出现的位置,很难与目的条带区分。没有条带可能是引物的问题,DNA量要求不大。buffer含镁离子的那种?
学习使你立于不败之地
6楼2014-05-18 16:52:17
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-18 17:09:06
反应体系中你的各种成分之间的配比好像不是很好! 建议你还是优化一下体系。模板的量,引物的量,还有酶的量都太多了!有些时候,酶过多并一定是好事!
7楼2014-05-18 17:08:00
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


吉部落zy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:54:47
如果你想排除引物二聚体的干扰,可以尝试一下换hot-start 酶,这个引物二聚体会少很多!
8楼2014-05-18 17:09:56
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


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吉部落zy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:54:58
你的 dNTP浓度是多少? 引物的浓度是多少?酶的活力是多少?这些加多加少是根据工作浓度来的,而不是根据体积来的,浓度大就少加,浓度下自然就多加
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2014-05-18 17:11:01
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
吉部落zy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:55:09
lz的20ul体系怎么少了1.5ul?初只看体系,DNA浓度在整个体系比例中高了,改成这样不知意下如何pcr  体系为20 ul:水  5ul
                     DNA:  4ul
                     buffer:2.5ul
                     dNTP:3.5ul
                    引物1::1.5
                   引物2:   1.5
                        酶:  2
有些东西因为得不到而变得美好,有些东西因为拥有而变得弥足珍贵!
10楼2014-05-18 17:17:56
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