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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr之后跑琼脂糖 优化，最后要跑聚丙烯酰胺的，希望大家给个优化方向，谢谢！
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吉部落zy

金虫 (小有名气)

[求助] pcr之后跑琼脂糖 优化，最后要跑聚丙烯酰胺的，希望大家给个优化方向，谢谢！ 已有6人参与

pcr  体系为20 ul：水  5ul
                     DNA：  5ul
                     buffer：2ul
                     dNTP：1.5ul
                    引物1：:1.5
                   引物2：   1.5
                        酶：  2
前三个是降落 pcr  靠近marker的是45 退货  35个c  谢谢了   给个建议进行优化！

pcr之后跑琼脂糖 优化，最后要跑聚丙烯酰胺的，希望大家给个优化方向，谢谢！
Administrator 2014-05-17 16 小时 34 分钟.jpg
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
1楼 2014-05-17 20:57:55
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-18 17:08:50
我不知道你的DNA浓度多大，但根据经验判断，20ul体系里面加四分之一体积的模版，是不是有点太多了？
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2楼2014-05-17 22:31:34
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的片段多大？建议减少下体系中各成分。
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学习使你立于不败之地
3楼2014-05-18 11:04:48
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 怎么都行 at 2014-05-17 22:31:34
我不知道你的DNA浓度多大，但根据经验判断，20ul体系里面加四分之一体积的模版，是不是有点太多了？

我是用试剂盒提的DNA   60ng/UL   前几次加2ul 几乎批不出来 ，后来试了三ul  不亮 最后加了5ul
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
4楼2014-05-18 15:33:49
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-05-18 11:04:48
你的目的片段多大？建议减少下体系中各成分。

80- 250 bp之间
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
5楼2014-05-18 15:34:17
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-18 17:08:59
图中亮的位置在100bp下，也是二聚体出现的位置，很难与目的条带区分。没有条带可能是引物的问题，DNA量要求不大。buffer含镁离子的那种？
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学习使你立于不败之地
6楼2014-05-18 16:52:17
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-18 17:09:06
反应体系中你的各种成分之间的配比好像不是很好！ 建议你还是优化一下体系。模板的量，引物的量，还有酶的量都太多了！有些时候，酶过多并一定是好事！
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7楼2014-05-18 17:08:00
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
吉部落zy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:54:47
如果你想排除引物二聚体的干扰，可以尝试一下换hot-start 酶，这个引物二聚体会少很多！
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8楼2014-05-18 17:09:56
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
吉部落zy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:54:58
你的 dNTP浓度是多少？ 引物的浓度是多少？酶的活力是多少？这些加多加少是根据工作浓度来的，而不是根据体积来的，浓度大就少加，浓度下自然就多加
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2014-05-18 17:11:01
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
吉部落zy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:55:09
lz的20ul体系怎么少了1.5ul？初只看体系，DNA浓度在整个体系比例中高了，改成这样不知意下如何pcr  体系为20 ul：水  5ul
                     DNA：  4ul
                     buffer：2.5ul
                     dNTP：3.5ul
                    引物1：:1.5
                   引物2：   1.5
                        酶：  2
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有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！
10楼2014-05-18 17:17:56
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