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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr之后跑琼脂糖 优化，最后要跑聚丙烯酰胺的，希望大家给个优化方向，谢谢！
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-05-18 16:52:17
图中亮的位置在100bp下，也是二聚体出现的位置，很难与目的条带区分。没有条带可能是引物的问题，DNA量要求不大。buffer含镁离子的那种？

buffer里有mg离子

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
11楼2014-05-18 20:54:02
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-05-18 11:04:48
你的目的片段多大？建议减少下体系中各成分。

目的片段  80-250之间的
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
12楼2014-05-19 12:06:24
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-18 17:11:01
你的 dNTP浓度是多少？ 引物的浓度是多少？酶的活力是多少？这些加多加少是根据工作浓度来的，而不是根据体积来的，浓度大就少加，浓度下自然就多加

dNTP是10mM  引物为10mM   没活力是 2U/ul
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
13楼2014-05-19 12:08:36
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 867575969 at 2014-05-18 17:17:56
lz的20ul体系怎么少了1.5ul？初只看体系，DNA浓度在整个体系比例中高了，改成这样不知意下如何pcr  体系为20 ul：水  5ul
                     DNA：  4ul
                     buffer：2.5ul
                ...

水加了7ul  dntp  加了1ul   其余正常
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14楼2014-05-19 12:10:28
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-05-18 16:52:17
图中亮的位置在100bp下，也是二聚体出现的位置，很难与目的条带区分。没有条带可能是引物的问题，DNA量要求不大。buffer含镁离子的那种？

如果是二聚体的话，那么亮度与模板DNA的量有关系么？
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
15楼2014-05-19 12:11:41
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 怎么都行 at 2014-05-17 22:31:34
我不知道你的DNA浓度多大，但根据经验判断，20ul体系里面加四分之一体积的模版，是不是有点太多了？

DNA是拿试剂盒提取的  大约50-100ng/ul之间 每次不定  开始加1ul  没有条带 ，以为是引物出了问题和dna浓度不够，后来加大dna的量  就出来了
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
16楼2014-05-19 12:14:51
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 12:52:25
引用回帖:
15楼: Originally posted by 吉部落zy at 2014-05-19 12:11:41
如果是二聚体的话，那么亮度与模板DNA的量有关系么？...

二聚体的产生主要与引物有关，比如引物自身结构，特异性等。跟DNA用量也有关系，如果引物有很好的特异性，能与DNA很好的结合，反而DNA用量低时二聚体会增多。当然也不排除与DNA质量有关，比如断裂等。你还要考虑PCR的条件。
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学习使你立于不败之地
17楼2014-05-19 12:21:56
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 吉部落zy at 2014-05-19 12:08:36
dNTP是10mM  引物为10mM   没活力是 2U/ul...

dNTP加0.4ul，酶加0.5ul，20ul的PCR体系是比较合适的
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2014-05-19 12:54:02
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TroyKing5513

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 19:00:29
我们实验室常用的是25或50ul体系的PCR，50的话，就是buffer 5，DNA 1，引物 一 1，引物二 1， dNTP    1，酶 1，水 40.  如果25体系的话就都减半。做过数十次了，即使是DNA浓度特别低也都能P出来。我用的引物是357和518.
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19楼2014-05-19 13:17:46
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吉部落zy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-19 12:54:02
dNTP加0.4ul，酶加0.5ul，20ul的PCR体系是比较合适的...

刚开始做的时候 ，加的和你的差不多，没批出来，可能是枪不好使，1ul以下几乎没有。。。
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我可以哭泣，可以悲伤，但我不可以不坚强。
20楼2014-05-19 18:34:21
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