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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？
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liuyil

银虫 (小有名气)

[求助] 大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？ 已有1人参与

大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？两边是一些随机连接的DNA片段，大小不一，大家出出注意！

大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？
Administrator 2014-04-24 21hr 26min.jpg
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
1楼 2014-04-25 09:40:27
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyil: 金币+5, ★有帮助 2014-04-25 13:09:04
liuyil: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2014-04-25 13:55:24
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-25 12:46:05
天使托   blackrose8089   凌波丽   cicelyzh   biostar2009   帮忙解决一下

这很正常，你20～70bp的DNA，大家都可以首尾相连的话，肯定成这样，产物大小说不定服从正态分布。

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-04-25 12:51:57
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+5, 十分感谢提供应助 2014-04-25 14:00:27
引用回帖:
6楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-25 13:08:27
是的，就是让这些小片段随机连接，但是我想的结果应该是一条条的带，我就是想看下条带大小的分布，连接的效率这些，怎么会出现这种情况，想了一早上没想通，求教啊...

能不能出现ladder，还是smear，这取决于你的检测系统的分辨率，更取决于你的DNA单体的大小分布，且不谈还有单链和环状产物的问题。
你要是20-70，比如5bp间隔分布的，别说连接之后，你就是连接之前，用agarose gel，仍然还是smear。
一个smear的DNA群体，连接不可能100%的效率，最后还是一个smear
如果再算上分子内连接产生的环状产物，这个问题没法分析。
另外一个方面，你的样品干不干净，这个非常影响分辨率。
很多工具酶，都有很强的DNA亲和力，比如一些内切酶，碱性磷酸酶，我记得T4 DNA ligase好像也是，说明书一般会强调。这种情况反应产物必须酚抽去蛋白之后才有可能跑得开。

我想起你了，你就是问T4PNK的那个是吧？

如果你听我的建议，如果你真心想去评估连接效率，你应该用同位素检测，即T4 PNk标记的时候，先让同位素标记上一部分，再大量加入ATP，连接之后，用碱性磷酸酶处理，看同位素信号还可以保留多少。你这个体系肯定是多份连接的。很多末端会连到分子内部，抵抗碱性磷酸酶的作用。
很多连接酶的活性跟踪就是这样做的。
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7楼2014-04-25 13:35:24
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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8楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-25 13:36:39
是不是片段太多了，大小太接近，所以连成一片，没法区分大小，所以成弥散状呢？其他的我想不出来了...

。。。
好吧，当我白说一通。。。
版主，别再@我了
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9楼2014-04-25 13:38:42
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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11楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-25 14:12:07
是的，之前也是您帮我解答的，听了您的建议。真的真的很感谢您这么真心的帮我，我真的是道行很浅，请原谅。我不是一定要去评估连接的效率，只是想看能不能通过连接反应后的电泳图大致判断下连接片段的长度，后续进 ...

呀呀，别搞这么客气，能解决问题就行
一般而言连接产物看不大出来大小的，你若想看大小，直接TA克隆了，用菌落PCR在你得到的克隆里面看，这个也能反映问题。
就是这有一点bias，小片段更容易连接，你要是较真，可以分段回收之后分别克隆。
如果只是大小不一，通过纯化DNA产物，用合适分辨率的胶，还是可以看清楚的
但是现在你这里面肯定有很多环化的产物，片段不太长的时候环化的比线性的跑得快，他在里面一搅合，你就搞不清楚了。
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13楼2014-04-25 14:26:26
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biostar2009

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22楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-27 20:57:30
之前看您生气了，我就觉得我这人太笨了，呵呵，以后可能还会麻烦前辈们!...

你现在在怎么搞捏？
柱纯化看你用什么柱，你要是用什么PCR回收柱，有大小bias，这个不好。你要是用G50之类的还行。
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23楼2014-04-27 21:09:28
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