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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？
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liuyil

银虫 (小有名气)

[求助] 大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？ 已有1人参与

大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？两边是一些随机连接的DNA片段，大小不一，大家出出注意！

大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？
Administrator 2014-04-24 21hr 26min.jpg
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
1楼 2014-04-25 09:40:27
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liuyil

银虫 (小有名气)
补充：这里面还有连接酶这些，连接后的产物，未纯化，只是想先跑个胶看下条带的分布，谢谢
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2楼2014-04-25 10:29:29
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-25 03:29:29
补充：这里面还有连接酶这些，连接后的产物，未纯化，只是想先跑个胶看下条带的分布，谢谢

补充：连接体系中是一些长度在20-70 bp的DNA小片段，然后在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，14 度，24 h，将连接产物直接跑1%的琼脂糖电泳，图就这样了，打下们帮忙分析下！
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3楼2014-04-25 11:54:44
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liuyil

银虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 05:51:57
这很正常，你20～70bp的DNA，大家都可以首尾相连的话，肯定成这样，产物大小说不定服从正态分布。
...

是的，就是让这些小片段随机连接，但是我想的结果应该是一条条的带，我就是想看下条带大小的分布，连接的效率这些，怎么会出现这种情况，想了一早上没想通，求教啊
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6楼2014-04-25 13:08:27
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 05:51:57
这很正常，你20～70bp的DNA，大家都可以首尾相连的话，肯定成这样，产物大小说不定服从正态分布。
...

是不是片段太多了，大小太接近，所以连成一片，没法区分大小，所以成弥散状呢？其他的我想不出来了
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8楼2014-04-25 13:36:39
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liuyil

银虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 06:38:42
。。。
好吧，当我白说一通。。。
版主，别再@我了...

不好意思，这个是我还没有看见你的回复的时候发的，太感谢你了
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10楼2014-04-25 13:54:49
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银虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 06:35:24
能不能出现ladder，还是smear，这取决于你的检测系统的分辨率，更取决于你的DNA单体的大小分布，且不谈还有单链和环状产物的问题。
你要是20-70，比如5bp间隔分布的，别说连接之后，你就是连接之前，用agarose ge ...

是的，之前也是您帮我解答的，听了您的建议。真的真的很感谢您这么真心的帮我，我真的是道行很浅，请原谅。我不是一定要去评估连接的效率，只是想看能不能通过连接反应后的电泳图大致判断下连接片段的长度，后续进行纯化再连接载体转化，由于对于基础知识的欠缺，所以可能说了些蠢话惹你生气了，抱歉哈！
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11楼2014-04-25 14:12:07
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 06:35:24
能不能出现ladder，还是smear，这取决于你的检测系统的分辨率，更取决于你的DNA单体的大小分布，且不谈还有单链和环状产物的问题。
你要是20-70，比如5bp间隔分布的，别说连接之后，你就是连接之前，用agarose ge ...

听了您的建议，我正在查阅相关的欠缺的知识，谢谢您
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12楼2014-04-25 14:12:47
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银虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by 不淡定 at 2014-04-27 02:52:09
降解了吧

这是刚用T4连接酶连接的产物直接进行的，应该不是讲解了，好像应该是这样，我认为biostar2009
说得很有道理。
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18楼2014-04-27 20:53:35
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liuyil

银虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by 天使托 at 2014-04-26 16:23:46
非特异性条件太多了....

这个不是PCR的，是小片段连接的，用的T4连接酶的，连接产物直接跑得1%的电泳。
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19楼2014-04-27 20:55:04
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