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liuyil

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[求助] 大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？已有1人参与

大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？两边是一些随机连接的DNA片段，大小不一，大家出出注意！

Administrator 2014-04-24 21hr 26min.jpg

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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。

1楼2014-04-25 09:40:27

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biostar2009

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西门吹雪170: 金币+5, 十分感谢提供应助 2014-04-25 14:00:27

引用回帖:

6楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-25 13:08:27
是的，就是让这些小片段随机连接，但是我想的结果应该是一条条的带，我就是想看下条带大小的分布，连接的效率这些，怎么会出现这种情况，想了一早上没想通，求教啊...

能不能出现ladder，还是smear，这取决于你的检测系统的分辨率，更取决于你的DNA单体的大小分布，且不谈还有单链和环状产物的问题。
你要是20-70，比如5bp间隔分布的，别说连接之后，你就是连接之前，用agarose gel，仍然还是smear。
一个smear的DNA群体，连接不可能100%的效率，最后还是一个smear
如果再算上分子内连接产生的环状产物，这个问题没法分析。
另外一个方面，你的样品干不干净，这个非常影响分辨率。
很多工具酶，都有很强的DNA亲和力，比如一些内切酶，碱性磷酸酶，我记得T4 DNA ligase好像也是，说明书一般会强调。这种情况反应产物必须酚抽去蛋白之后才有可能跑得开。

我想起你了，你就是问T4PNK的那个是吧？

如果你听我的建议，如果你真心想去评估连接效率，你应该用同位素检测，即T4 PNk标记的时候，先让同位素标记上一部分，再大量加入ATP，连接之后，用碱性磷酸酶处理，看同位素信号还可以保留多少。你这个体系肯定是多份连接的。很多末端会连到分子内部，抵抗碱性磷酸酶的作用。
很多连接酶的活性跟踪就是这样做的。