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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
如果总不行,是不是要考虑你的pcr产物的酶切位点有问题,也就是说有可能根本就切不动,影响后面的连接。实验并不难,运气好一个月能做完。再接再厉吧!
细推物理须行乐。
2楼2008-03-05 19:01:01
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傻子

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
可以考虑把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切,这样比较稳定
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
3楼2008-03-05 19:06:24
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annwt

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
你是如何判断PCR产物切开的哪?,应该无法判断,建议PCR产物先连T载体,再与你的质粒一起切再;连接转化,也许这样麻烦,但是是笨方法,有效的笨方法。
4楼2008-03-05 19:06:54
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

可是与T-载体的连接不是一样的要用同样的酶切啊,经历同样的过程,也有可能连接不上把,究竟和一般的质粒连接有什么区别呢?
5楼2008-03-05 19:11:58
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傻子

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
T载体是高效的简易连接的载体,可以平端连接,PCR产物只要加了ploy A尾巴的就可以连接,不需要酶切等步骤
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
6楼2008-03-05 19:18:18
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annwt

木虫 (正式写手)

加A应该很简单,不必担心。
7楼2008-03-05 20:36:08
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pkuzjksjj

新虫 (初入文坛)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):THX
一般来说,电泳回收后,DNA的量会减少很多,如果不跑电泳直接回收,尤其是载体的话,可以得到更多的阳克隆.不过这样做的前提是,一定要先电泳确定质粒被酶完全切开.
不用T载体的话也没有太大关系,PCR产物的量一般会比质粒多,如果没有被切的产物是和质粒连不上的.
另外,可以尝试增长连接时间,16度16个小时左右一般是没有问题的.
最后检查一下酶切位点,如果位点错了,是无论如何也做不出来的
8楼2008-03-05 22:07:53
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xuedan005

木虫 (正式写手)

可能是质粒有问题
9楼2008-03-05 22:14:35
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GinTonic

金虫 (小有名气)

俺是个新手
也要做了
看了各位虫友的话感觉很受启发
真是非常感谢
10楼2008-03-06 00:07:08
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