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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

PCR产物单酶切还是双酶切?
11楼2008-03-06 08:05:00
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sofu

金虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
注意加保护碱基
"An expert is a man who has made all the mistakes which can be made, in a very narrow field." -- Niels Henrik David Bohr
12楼2008-03-06 08:23:34
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shqing

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
考虑pcr产物的酶切位点有问题,有可能根本就切不动,影响后面的连接
13楼2008-03-06 09:28:09
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wangjun0457

银虫 (小有名气)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
如果你用的载体太大,也会影响到转化效率,还有感受态细胞是不是有问题。
14楼2008-03-06 14:25:42
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

我 的质粒8Kb,片段1.5kb,感受态绝对没有问题,因为空载转化效率很高,保护碱基都加了应该也足够,酶切位点也都试验过都能切开。

所有的东西都没有问题,就是出不来啊。。
15楼2008-03-06 15:34:17
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随风而过

银虫 (小有名气)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
你现在说遇到的问题,你应该注意以下几点:
1.每一步都要做鉴定,这样你就能知道问题出在那个步骤。比如你你能确定是没扩增出来还是没有切开还是没有连上。
2.你需要知道你现在所用的制作感受态的菌种是否出了问题,如果出问题你选的阳性菌落不一定是你要的,我曾经遇到过这样的问题,换没有问题的菌种再做。
16楼2008-03-06 16:00:51
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dreamsail

银虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
俺去年做的时候开始也老是出不来.
后来把感受态换了,浓度也加了,就好了.
你试下.
17楼2008-03-06 16:39:46
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clf0803

银虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
你用的是那俩个酶?因为不同的酶的酶切条件以及酶切难易程度不一样。如果两个没差别比较大的话,就要让难切的先切再切另一个,如果同时双酶切的话,很可能结果只是单酶切。
18楼2008-03-06 20:25:46
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model031

银虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
说实话,做克隆有时候要看运气,运气好,不出一月就可以出来结果,运气不好,可要多花点时间了.我的情况跟楼主你的差不多,我开始的连接很幸运,挑了12个基本都是阳性的.我载体是8400左右,片段620左右 我载体的用量20ng,载体片段的摩尔比是1:5  我们实验室也有按1:100连的,反正就是载体尽量少,加大片段用量,你再试试.
19楼2008-03-07 09:36:28
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
不太同意楼上的看法,插入片段不是越多越好,楼主的1:8-1:10我都觉得偏高了。我曾经试过,做到1:10的连接效率反而比1:3低。
要知道连接反应中载体和片段首先要无限接近,这个过程是通过布朗运动实现的。如果片段太多,他们之间相互接触的机会远远大于片段和载体接触的机会。所以我觉得“过犹不及”,不要加入太多的片段。
1:3这个比例是怎么来的,分子克隆上面有详细的动力学计算过程,还是有参考意义的。
20楼2008-03-07 10:43:55
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