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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
PCR产物单酶切还是双酶切？
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11楼2008-03-06 08:05:00
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sofu

金虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
注意加保护碱基
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"An expert is a man who has made all the mistakes which can be made, in a very narrow field." -- Niels Henrik David Bohr
12楼2008-03-06 08:23:34
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shqing

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
考虑pcr产物的酶切位点有问题，有可能根本就切不动，影响后面的连接
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13楼2008-03-06 09:28:09
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wangjun0457

银虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
如果你用的载体太大，也会影响到转化效率，还有感受态细胞是不是有问题。
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14楼2008-03-06 14:25:42
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
我 的质粒8Kb，片段1.5kb，感受态绝对没有问题，因为空载转化效率很高，保护碱基都加了应该也足够，酶切位点也都试验过都能切开。

所有的东西都没有问题，就是出不来啊。。
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15楼2008-03-06 15:34:17
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随风而过

银虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
你现在说遇到的问题，你应该注意以下几点：
1.每一步都要做鉴定，这样你就能知道问题出在那个步骤。比如你你能确定是没扩增出来还是没有切开还是没有连上。
2.你需要知道你现在所用的制作感受态的菌种是否出了问题，如果出问题你选的阳性菌落不一定是你要的，我曾经遇到过这样的问题，换没有问题的菌种再做。
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16楼2008-03-06 16:00:51
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dreamsail

银虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
俺去年做的时候开始也老是出不来.
后来把感受态换了,浓度也加了,就好了.
你试下.
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17楼2008-03-06 16:39:46
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clf0803

银虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
你用的是那俩个酶？因为不同的酶的酶切条件以及酶切难易程度不一样。如果两个没差别比较大的话，就要让难切的先切再切另一个，如果同时双酶切的话，很可能结果只是单酶切。
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18楼2008-03-06 20:25:46
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model031

银虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
说实话,做克隆有时候要看运气,运气好,不出一月就可以出来结果,运气不好,可要多花点时间了.我的情况跟楼主你的差不多,我开始的连接很幸运,挑了12个基本都是阳性的.我载体是8400左右,片段620左右 我载体的用量20ng,载体片段的摩尔比是1:5  我们实验室也有按1:100连的,反正就是载体尽量少,加大片段用量,你再试试.
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19楼2008-03-07 09:36:28
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
不太同意楼上的看法，插入片段不是越多越好，楼主的1：8－1：10我都觉得偏高了。我曾经试过，做到1：10的连接效率反而比1：3低。
要知道连接反应中载体和片段首先要无限接近，这个过程是通过布朗运动实现的。如果片段太多，他们之间相互接触的机会远远大于片段和载体接触的机会。所以我觉得“过犹不及”，不要加入太多的片段。
1：3这个比例是怎么来的，分子克隆上面有详细的动力学计算过程，还是有参考意义的。
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20楼2008-03-07 10:43:55
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