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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
不太同意楼上的看法,插入片段不是越多越好,楼主的1:8-1:10我都觉得偏高了。我曾经试过,做到1:10的连接效率反而比1:3低。
要知道连接反应中载体和片段首先要无限接近,这个过程是通过布朗运动实现的。如果片段太多,他们之间相互接触的机会远远大于片段和载体接触的机会。所以我觉得“过犹不及”,不要加入太多的片段。
1:3这个比例是怎么来的,分子克隆上面有详细的动力学计算过程,还是有参考意义的。
20楼2008-03-07 10:43:55
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
如果总不行,是不是要考虑你的pcr产物的酶切位点有问题,也就是说有可能根本就切不动,影响后面的连接。实验并不难,运气好一个月能做完。再接再厉吧!
细推物理须行乐。
2楼2008-03-05 19:01:01
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傻子

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
可以考虑把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切,这样比较稳定
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
3楼2008-03-05 19:06:24
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annwt

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
你是如何判断PCR产物切开的哪?,应该无法判断,建议PCR产物先连T载体,再与你的质粒一起切再;连接转化,也许这样麻烦,但是是笨方法,有效的笨方法。
4楼2008-03-05 19:06:54
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