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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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1楼 2008-03-05 18:55:06
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
如果总不行，是不是要考虑你的pcr产物的酶切位点有问题，也就是说有可能根本就切不动，影响后面的连接。实验并不难，运气好一个月能做完。再接再厉吧！
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细推物理须行乐。
2楼2008-03-05 19:01:01
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傻子

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
可以考虑把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切，这样比较稳定
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
3楼2008-03-05 19:06:24
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annwt

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
你是如何判断PCR产物切开的哪？，应该无法判断，建议PCR产物先连T载体，再与你的质粒一起切再；连接转化，也许这样麻烦，但是是笨方法，有效的笨方法。
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4楼2008-03-05 19:06:54
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
可是与T-载体的连接不是一样的要用同样的酶切啊,经历同样的过程,也有可能连接不上把,究竟和一般的质粒连接有什么区别呢?
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5楼2008-03-05 19:11:58
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傻子

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
T载体是高效的简易连接的载体，可以平端连接，PCR产物只要加了ploy A尾巴的就可以连接，不需要酶切等步骤
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
6楼2008-03-05 19:18:18
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annwt

木虫 (正式写手)
加A应该很简单，不必担心。
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7楼2008-03-05 20:36:08
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pkuzjksjj

新虫 (初入文坛)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):THX
一般来说，电泳回收后，DNA的量会减少很多，如果不跑电泳直接回收，尤其是载体的话，可以得到更多的阳克隆．不过这样做的前提是，一定要先电泳确定质粒被酶完全切开．
不用T载体的话也没有太大关系，PCR产物的量一般会比质粒多，如果没有被切的产物是和质粒连不上的．
另外，可以尝试增长连接时间，１６度１６个小时左右一般是没有问题的．
最后检查一下酶切位点，如果位点错了，是无论如何也做不出来的
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8楼2008-03-05 22:07:53
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xuedan005

木虫 (正式写手)
可能是质粒有问题
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9楼2008-03-05 22:14:35
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GinTonic

金虫 (小有名气)
俺是个新手
也要做了
看了各位虫友的话感觉很受启发
真是非常感谢
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10楼2008-03-06 00:07:08
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