24小时热门版块排行榜    

查看: 3392  |  回复: 37
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傻子

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
T载体是高效的简易连接的载体,可以平端连接,PCR产物只要加了ploy A尾巴的就可以连接,不需要酶切等步骤
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
6楼2008-03-05 19:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 38 个回答

lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
如果总不行,是不是要考虑你的pcr产物的酶切位点有问题,也就是说有可能根本就切不动,影响后面的连接。实验并不难,运气好一个月能做完。再接再厉吧!
细推物理须行乐。
2楼2008-03-05 19:01:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傻子

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
可以考虑把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切,这样比较稳定
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
3楼2008-03-05 19:06:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

annwt

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
你是如何判断PCR产物切开的哪?,应该无法判断,建议PCR产物先连T载体,再与你的质粒一起切再;连接转化,也许这样麻烦,但是是笨方法,有效的笨方法。
4楼2008-03-05 19:06:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +11 yufeiwaner 2026-08-09 12/600 2026-08-12 01:27 by 南京中西医
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +17 Lanmanbaby 2026-08-09 29/1450 2026-08-12 00:24 by zhanghaozhu
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +8 Tide man 2026-08-10 9/450 2026-08-11 20:39 by beefly
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +3 工厂打螺丝 2026-08-08 3/150 2026-08-11 13:42 by 会议编辑
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 基金中了 +15 laoda193707 2026-08-06 15/750 2026-08-11 00:11 by jiafei2190
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +3 majunge000 2026-08-10 3/150 2026-08-10 15:46 by lch2012
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 固定端突然变了,今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧,后缀研究没有意义,别浪费时间了,过好目前的每一天,不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 好消息?这个有何含义??? +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
信息提示
请填处理意见