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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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pkuzjksjj

新虫 (初入文坛)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):THX
一般来说,电泳回收后,DNA的量会减少很多,如果不跑电泳直接回收,尤其是载体的话,可以得到更多的阳克隆.不过这样做的前提是,一定要先电泳确定质粒被酶完全切开.
不用T载体的话也没有太大关系,PCR产物的量一般会比质粒多,如果没有被切的产物是和质粒连不上的.
另外,可以尝试增长连接时间,16度16个小时左右一般是没有问题的.
最后检查一下酶切位点,如果位点错了,是无论如何也做不出来的
8楼2008-03-05 22:07:53
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