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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)
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biogefart

木虫 (著名写手)

用的啥胶回收试剂盒？

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
我曾经和你一样，最后发现是胶回收试剂盒回收率太低，回收完跑个电泳看看，至少肉眼要看得见。
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闹太套
31楼2008-03-16 05:48:23
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yellow.

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
直接pcr产物酶切，因为保护碱基毕竟保护水平有限，酶切不完全的，尤其是Nde1（建议开始酶切时加一半酶，半小时后再补加），回收到的不一定都是酶切开的，所以建议用T载体。
载体酶切时可加点去磷酸酶（个人觉得没强烈必要，但鉴于你后来说假阳性较多，才建议的）
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32楼2008-03-16 10:13:25
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
请问楼上的，如果是双酶切，用不同的酶来切造成粘性末端的话也可以用碱性磷酸酶处理吗？只处理质粒吗、片段需要去磷酸化吗？
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33楼2008-03-17 23:51:41
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
请问有人用过NarI这个酶吗
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34楼2008-03-23 13:33:05
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
先连接T载体吧，再酶切回收时：目的片断的量大；将表达载体一起切，只要T载体上的片断切下来了，表达载体的酶切位点也应该切开了。
这样，就不用再检测酶的活力之类的事情了。

要保证感受态的质量，最省事、有效的办法是买商业感受态。TIANGEN的感受态在16RMB左右，一枝可以用两次，效果不错。我们实验室连接表达载体时都是用商业感受态，效率高，节省时间。
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35楼2008-03-23 14:14:00
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istillholdon

铜虫 (正式写手)
在feesee.com上找Dolly·s  legacy 里面可能有你要的答案。。。
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Ikeepholdingontotheinnocencethatyouhave.
36楼2008-03-25 01:27:01
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shuchang

金虫 (初入文坛)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
做实验一定要设好对照。
载体双切完后，跑胶回收是必要的，回收后自联转化看看，如果自联转化的出来，说明双切的效果不好，那最好就顺序单酶切。只要载体双切制备好了，应该不太可能出现楼主这样的问题。
此外，适当的延长酶切时间也能改善酶切效果，切十个小时都无妨。
PCR产物切完没必要跑胶回收，酚氯仿抽提后乙醇沉淀既可。

[ Last edited by shuchang on 2008-3-25 at 01:43 ]
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37楼2008-03-25 01:37:38
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silentguy

铜虫 (小有名气)

你的摇菌时间是多长？

★ ★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.. 新虫鼓励奖2个, 让你更开心
我们这边有两个同学都是一开始没做出来，后来延长摇菌时间，一个摇了1夜，还有一个摇了两个晚上，后来电泳都出来了。
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38楼2008-03-25 10:43:38
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