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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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1楼 2008-03-05 18:55:06
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yellow.

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
直接pcr产物酶切，因为保护碱基毕竟保护水平有限，酶切不完全的，尤其是Nde1（建议开始酶切时加一半酶，半小时后再补加），回收到的不一定都是酶切开的，所以建议用T载体。
载体酶切时可加点去磷酸酶（个人觉得没强烈必要，但鉴于你后来说假阳性较多，才建议的）
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32楼2008-03-16 10:13:25
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
如果总不行，是不是要考虑你的pcr产物的酶切位点有问题，也就是说有可能根本就切不动，影响后面的连接。实验并不难，运气好一个月能做完。再接再厉吧！
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细推物理须行乐。
2楼2008-03-05 19:01:01
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傻子

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
可以考虑把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切，这样比较稳定
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
3楼2008-03-05 19:06:24
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annwt

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
你是如何判断PCR产物切开的哪？，应该无法判断，建议PCR产物先连T载体，再与你的质粒一起切再；连接转化，也许这样麻烦，但是是笨方法，有效的笨方法。
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4楼2008-03-05 19:06:54
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