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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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yellow.

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
直接pcr产物酶切,因为保护碱基毕竟保护水平有限,酶切不完全的,尤其是Nde1(建议开始酶切时加一半酶,半小时后再补加),回收到的不一定都是酶切开的,所以建议用T载体。
载体酶切时可加点去磷酸酶(个人觉得没强烈必要,但鉴于你后来说假阳性较多,才建议的)
32楼2008-03-16 10:13:25
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