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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)
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maria229

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
引物上酶切位点的保护碱基是不是加的少了，有的酶不好切，需要加多一些保护碱基。

回收是用kit吗？有的kit并不好，会破坏载体或PCR产物。

另外，最好根据浓度估算一下，一般二者以摩尔比3：1比进行连接。
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21楼2008-03-07 11:22:55
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fkz

荣誉版主 (著名写手)

小木虫互联山庄CEO
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
先考虑稳定性,应该把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切， 最关键的是酶切位点，如果位点错了，那就不是运气好坏的问题了.
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朔漠长歌，落日斜影，高山流水，闻弦鸣音，不求闻达，但慕归云，随喜随缘，自然而然。
22楼2008-03-07 21:10:09
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威风之狼

金虫 (小有名气)
PCr双酶切是看不出来 切开与否吧
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23楼2008-03-11 14:43:16
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veterinary99

至尊木虫 (著名写手)

鸱夷子皮
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
1 空载体有的话证明转化和感受态没问题，连接酶呢 用kit还是T4，可以把空载体切了再连做转化以确定是否是连接酶的问题。其实载体和片段1：3-1：10都可以。
2 所选的酶是否可以在同一温度下切，切的条件（甘油浓度 时间 酶浓度 酶本身）可能导致星号活性，切了非酶切位点。
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华枝春满 天心月圆
24楼2008-03-12 02:41:23
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
谢谢诸位，最近每次克隆都是切三个小时，大概是1微克的质粒，100微升PCR产物，可是最后转化出来后长出的单斑发现都是原来的质粒一样的。

这是不是说明没有酶切完全？（我用的双切Buffer,两个酶的活性都是75－100％）
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25楼2008-03-13 14:35:16
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yzdjyj

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
只要没切位点没错的话一般都能切开，连不连T载体无所谓。确保没错的前提下建议调整一下产物连接比例，不能单纯看浓度，理论上是看mol比，也就是你insert的浓度除以其大小比上vector的浓度除以其大小在3:1左右较合适。
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撇捺人生
26楼2008-03-13 16:40:35
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木虫小小

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.. 新虫鼓励奖2个, 让你更开心
一定要在引物的酶切位点前加保护碱基,而且不同的酶切位点需要添加的保护碱基一般也不同,这个很关键,我们就碰到过同样的问题,后来检查了保护碱基就P出来了,可以试试看.
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27楼2008-03-14 10:25:19
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bio830805

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
曾经也有过类似的经历，不过后来改用连接T载体后再酶切就好了，我以前其中一个酶是NdeI，所以需要切过夜，因此你还要看看自己的酶切位点对不对，另外限制性内切酶所需要的酶切条件和时间怎样，是双酶一起切还是顺序单酶切，另外在网上有说提高连接效率的小技巧，具体内容在http://www.protocol-online.org/p ... ting-step-2601.html，希望对你有帮助
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不会跳舞的外语达人不是好生物学家
28楼2008-03-14 10:51:24
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
不知道该怎么发给他们金币呢？
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29楼2008-03-15 18:11:31
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jerome711

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
对你的情况我身表同情，我马上也要做重组了，希望一切顺利。
另外多请教一下可以面见的高手，我以前P土壤，做的不是很顺利，不过最后还是柳暗花明，坚持。
祝你好运。
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做懂得生活的人
30楼2008-03-15 23:34:44
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