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maria229

木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
引物上酶切位点的保护碱基是不是加的少了,有的酶不好切,需要加多一些保护碱基。

回收是用kit吗?有的kit并不好,会破坏载体或PCR产物。

另外,最好根据浓度估算一下,一般二者以摩尔比3:1比进行连接。
21楼2008-03-07 11:22:55
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fkz

荣誉版主 (著名写手)

小木虫互联山庄CEO


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.谢谢交流
先考虑稳定性,应该把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切, 最关键的是酶切位点,如果位点错了,那就不是运气好坏的问题了.
朔漠长歌,落日斜影,高山流水,闻弦鸣音,不求闻达,但慕归云,随喜随缘,自然而然。
22楼2008-03-07 21:10:09
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威风之狼

金虫 (小有名气)

PCr双酶切是看不出来 切开与否吧
23楼2008-03-11 14:43:16
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veterinary99

至尊木虫 (著名写手)

鸱夷子皮

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
1 空载体有的话证明转化和感受态没问题,连接酶呢 用kit还是T4,可以把空载体切了再连做转化以确定是否是连接酶的问题。其实载体和片段1:3-1:10都可以。
2 所选的酶是否可以在同一温度下切,切的条件(甘油浓度 时间 酶浓度 酶本身)可能导致星号活性,切了非酶切位点。
华枝春满 天心月圆
24楼2008-03-12 02:41:23
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

谢谢诸位,最近每次克隆都是切三个小时,大概是1微克的质粒,100微升PCR产物,可是最后转化出来后长出的单斑发现都是原来的质粒一样的。

这是不是说明没有酶切完全?(我用的双切Buffer,两个酶的活性都是75-100%)
25楼2008-03-13 14:35:16
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yzdjyj

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
只要没切位点没错的话一般都能切开,连不连T载体无所谓。确保没错的前提下建议调整一下产物连接比例,不能单纯看浓度,理论上是看mol比,也就是你insert的浓度除以其大小比上vector的浓度除以其大小在3:1左右较合适。
撇捺人生
26楼2008-03-13 16:40:35
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木虫小小

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.. 新虫鼓励奖2个, 让你更开心
一定要在引物的酶切位点前加保护碱基,而且不同的酶切位点需要添加的保护碱基一般也不同,这个很关键,我们就碰到过同样的问题,后来检查了保护碱基就P出来了,可以试试看.
27楼2008-03-14 10:25:19
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bio830805

银虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
曾经也有过类似的经历,不过后来改用连接T载体后再酶切就好了,我以前其中一个酶是NdeI,所以需要切过夜,因此你还要看看自己的酶切位点对不对,另外限制性内切酶所需要的酶切条件和时间怎样,是双酶一起切还是顺序单酶切,另外在网上有说提高连接效率的小技巧,具体内容在http://www.protocol-online.org/p ... ting-step-2601.html,希望对你有帮助
不会跳舞的外语达人不是好生物学家
28楼2008-03-14 10:51:24
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

不知道该怎么发给他们金币呢?
29楼2008-03-15 18:11:31
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jerome711

银虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
对你的情况我身表同情,我马上也要做重组了,希望一切顺利。
另外多请教一下可以面见的高手,我以前P土壤,做的不是很顺利,不过最后还是柳暗花明,坚持。
祝你好运。
做懂得生活的人
30楼2008-03-15 23:34:44
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