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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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veterinary99

至尊木虫 (著名写手)

鸱夷子皮

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
1 空载体有的话证明转化和感受态没问题,连接酶呢 用kit还是T4,可以把空载体切了再连做转化以确定是否是连接酶的问题。其实载体和片段1:3-1:10都可以。
2 所选的酶是否可以在同一温度下切,切的条件(甘油浓度 时间 酶浓度 酶本身)可能导致星号活性,切了非酶切位点。
华枝春满 天心月圆
24楼2008-03-12 02:41:23
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