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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
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maria229

木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
引物上酶切位点的保护碱基是不是加的少了,有的酶不好切,需要加多一些保护碱基。

回收是用kit吗?有的kit并不好,会破坏载体或PCR产物。

另外,最好根据浓度估算一下,一般二者以摩尔比3:1比进行连接。
21楼2008-03-07 11:22:55
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