24小时热门版块排行榜    

查看: 3389  |  回复: 37
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

[交流] 急!急!急!为什么克隆总是失败?(散100金币求助)

做分子克隆做了快一年了,可是除了有两次运气好连接上一个片段后,再也没有做出来过.

都快急死了!不明白到底是哪里出了问题,请高手指点啊.

一般质粒切3-4个小时,PCR产物片段一起切,然后电泳回收,按照浓度大概8:1--10:1的比例连接,质粒一般用量为50-100ng.转化,然后挑斑,可是总是失败,请问为什么呀?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

可是与T-载体的连接不是一样的要用同样的酶切啊,经历同样的过程,也有可能连接不上把,究竟和一般的质粒连接有什么区别呢?
5楼2008-03-05 19:11:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 38 个回答

lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
如果总不行,是不是要考虑你的pcr产物的酶切位点有问题,也就是说有可能根本就切不动,影响后面的连接。实验并不难,运气好一个月能做完。再接再厉吧!
细推物理须行乐。
2楼2008-03-05 19:01:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傻子

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
可以考虑把有酶切位点片段的PCR产物先连上T载体再切,这样比较稳定
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
3楼2008-03-05 19:06:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

annwt

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):THX
你是如何判断PCR产物切开的哪?,应该无法判断,建议PCR产物先连T载体,再与你的质粒一起切再;连接转化,也许这样麻烦,但是是笨方法,有效的笨方法。
4楼2008-03-05 19:06:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +11 yufeiwaner 2026-08-09 12/600 2026-08-12 01:27 by 南京中西医
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +4 Tide man 2026-08-11 4/200 2026-08-12 00:39 by liuqidi
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +3 工厂打螺丝 2026-08-08 3/150 2026-08-11 13:42 by 会议编辑
[基金申请] 听说今天filecode变了 +26 布布和一二 2026-08-06 49/2450 2026-08-11 13:18 by WH3796
[基金申请] FileCode能看出啥? +7 要乐观耀哥 2026-08-10 17/850 2026-08-11 10:50 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode,很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了,今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
信息提示
请填处理意见