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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助关于质粒
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lyz65956

木虫 (正式写手)

[交流] 求助关于质粒

有一批别人赠送的克隆质粒， 各种原因， 无法知道其详细信息。
知道有我的目的基因大概七八千， 但是由于是环状DNA想通过测序找到其线性化位点
试过许多的通用引物 比如 M13 T7等 测序了大部分。
其中有小部分无法测序成功，或者测到的序列为载体序列，将测到的序列比对发现为载体序列 但是有很多的载体，
请问有什么办法可以测序，判断出到底什么载体 或者更好的办法知道 目的基因的线性位点
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对自己更好点
1楼 2014-04-11 13:58:29
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lyz65956

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-11 14:18:54
至少你还知道你的基因序列，里面有什么位点是清楚的。
这个时候，就不要去找通用引物了。
你的序列已知，一头一尾设计个引物，测头尾，看看头尾有没有剩下什么酶切位点。
这事不就结了。

因为原来的目的序列是环状的 所以我不知道头和尾在哪里
用特异性引物测了2K硬是没找出来。。。
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对自己更好点
3楼2014-04-11 14:21:18
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★ ★ ★
lyz65956(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-30 14:00:42
至少你还知道你的基因序列，里面有什么位点是清楚的。
这个时候，就不要去找通用引物了。
你的序列已知，一头一尾设计个引物，测头尾，看看头尾有没有剩下什么酶切位点。
这事不就结了。
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2楼2014-04-11 14:18:54
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyz65956 at 2014-04-11 14:21:18
因为原来的目的序列是环状的 所以我不知道头和尾在哪里
用特异性引物测了2K硬是没找出来。。。...

我大概懂你的情况了，就是说你要的基因，自然情况也是个圈，现在套在更大的一个质粒圈里面了？
然后还有七八千。。。
一个省事的办法，就是继续测，总能测到载体上的，这样你一旦知道一个头，肯定另一个也知道了。
另一个复杂一点也不见得搞得出来的办法，找到你基因上的酶切位点，
两两组合去切
虽然载体上可能也有这个位点会掉下来片段，但是应该不影响
关注你两两组合的产物大小存不存在
比如HindIII BamHI XhoI XbaI
比如HindIII和BamHI中间应该是2K，如果掉下来是2K，那说明这中间是连着的
如果掉下来不是2K，变得很大，那说明线性化装入载体这个大圈的位置应该就在这两个位点中间。
呵呵，这个等于在做物理图谱了
虽然麻烦一点，但是可能会比测序更快，你一次可以切很多组合。
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lyz65956
7楼2014-04-11 14:41:10
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lyz65956

木虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-11 14:41:10
我大概懂你的情况了，就是说你要的基因，自然情况也是个圈，现在套在更大的一个质粒圈里面了？
然后还有七八千。。。
一个省事的办法，就是继续测，总能测到载体上的，这样你一旦知道一个头，肯定另一个也知道了 ...

恩 明白了 谢谢
看来果然没有什么比较简便的方法
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对自己更好点
10楼2014-04-11 15:05:31
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