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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 原代心肌细胞培养
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zxz91

铜虫 (小有名气)

[求助] 原代心肌细胞培养 已有5人参与

我目前正在做原代心肌细胞培养，但结果不太理想，死细胞特别多，贴壁细胞很少，并且观察不到搏动。现将整个造作流程写出，请求做原代心肌细胞培养成功的大师们给点建议：培养液为含10%血清（BI）及1%双抗的DMEM高糖，胰酶为碧云天的浓度0.25%含0.02%EDTA。
KM乳鼠75%酒精消毒后取心于预冷的培养液中，清洗血管及纤维组织后转移到另一遇冷的培养液中，将心脏剪碎，每颗心剪成2-3块，吸至15ml离心管，胰酶清洗，上清液弃去，之后加组织块2倍体积的胰酶，37度水浴消化20s，取上清用培养液终止消化，反复操作，直至组织块消化完全。200目滤网3层过滤，1500转，离心5min，制成细胞悬液，种到培养瓶中，90min后分离心肌与成纤维。
请问该过程哪里有问题吗？细胞为什么不活？
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1楼 2014-03-25 18:43:04
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回帖置顶 ( 共有1个 )

chenxiangfan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 谢谢参与 2014-03-27 09:32:08
我也是用的碧云天的胰酶，消化的时候用锡箔纸封口，在水浴中微微的震荡，5-6分钟，吸取上清要彻底些，反复7-8次。还有就是养心肌细胞最好可以用层黏连蛋白预处理包被，这样促进贴壁和存活，还有就是差速贴壁后要用BRDU除去杂细胞，比如成纤维细胞。
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梅花香自苦寒来
4楼2014-03-27 09:18:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

真心的笑

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zxz91 at 2014-03-27 09:13:44
谢谢，给我指出一条道路。我想按您说的方法试一试，但有几个疑惑想请教一下，用0.25%胰酶软化5min不会笑话过吗？之后用0.08%的胰酶，可以用0.1%的胰酶吗？差别会很大吗？...

不会消化过度的，你0.25%消化是把心肌组织软化（弃上清时不要吹打），目的是方便以后消化，这样快点。后面可以用0.1%的，时间在7min左右吧（那么高的浓度，在消化到后面可以根据你组织的消化情况来适当减少时间），吹打时动作尽量轻柔。期间会出现很多像鼻涕一样的胶装物，其实那里面的细胞室最多的，千万不能丢。每次消化收上清，尽量吸完。
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5楼2014-03-27 09:55:45
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真心的笑

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-25 22:26:37
乳鼠取1-3d的，只取心尖部分，剪成0.5-1mm3大小。0.25%胰酶先软化5分钟，弃上清；0.08%胰酶消化（4-6mL)8min,消化7-8次(消化时放在培养箱里面封口消化，每2min拿出来震摇一下），收集每次上清（先轻微吹打10到15次），加入等体积的DMEM终止消化。1000转，离心8分钟，200目过滤后，接种到培养瓶中，差速贴壁2h.你试试。
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2楼2014-03-25 20:50:25
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zxz91

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 真心的笑 at 2014-03-25 20:50:25
乳鼠取1-3d的，只取心尖部分，剪成0.5-1mm3大小。0.25%胰酶先软化5分钟，弃上清；0.08%胰酶消化（4-6mL)8min,消化7-8次(消化时放在培养箱里面封口消化，每2min拿出来震摇一下），收集每次上清（先轻微吹打10到15次） ...

谢谢，给我指出一条道路。我想按您说的方法试一试，但有几个疑惑想请教一下，用0.25%胰酶软化5min不会笑话过吗？之后用0.08%的胰酶，可以用0.1%的胰酶吗？差别会很大吗？
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3楼2014-03-27 09:13:44
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zxz91

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 真心的笑 at 2014-03-27 09:55:45
不会消化过度的，你0.25%消化是把心肌组织软化（弃上清时不要吹打），目的是方便以后消化，这样快点。后面可以用0.1%的，时间在7min左右吧（那么高的浓度，在消化到后面可以根据你组织的消化情况来适当减少时间）， ...

谢谢您
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6楼2014-03-27 16:28:36
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zxz91

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 真心的笑 at 2014-03-27 09:55:45
不会消化过度的，你0.25%消化是把心肌组织软化（弃上清时不要吹打），目的是方便以后消化，这样快点。后面可以用0.1%的，时间在7min左右吧（那么高的浓度，在消化到后面可以根据你组织的消化情况来适当减少时间）， ...

我昨天新做的一次原代培养，24h后观察发现细胞贴壁依然很少，这是按之前的方法做的，下次按您说的方法改进一下，之前实验室有人拿大鼠胎鼠做过，所以我想问一下您，大鼠和小鼠会影响结果吗？差速后加BRDU的浓度我之前用的是0.01mol/L,是不是浓度有点大，我看文献上又说用0.1mmol/L的
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7楼2014-03-27 16:43:57
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真心的笑

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zxz91 at 2014-03-27 16:43:57
我昨天新做的一次原代培养，24h后观察发现细胞贴壁依然很少，这是按之前的方法做的，下次按您说的方法改进一下，之前实验室有人拿大鼠胎鼠做过，所以我想问一下您，大鼠和小鼠会影响结果吗？差速后加BRDU的浓度我之 ...

是0.1mmol/L,我用的是SD大鼠生的乳鼠
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8楼2014-03-27 19:20:03
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windbells636

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

光用胰酶不行的，要用混合酶，再加差速贴壁法
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9楼2014-04-15 09:58:48
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liboliu2007

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1、胰酶不要用含EDTA的，EDTA影响贴壁并且血清不能中止消化。
2、0.25%胰酶消化太剧烈。如果条件可建议联用胶原酶I型或II型0.1%浓度（联用的话胰酶浓度可调到0.125%）。
3、心肌细胞原代培养条件要求非常苛刻，建议加用促生长因子，对于贴壁及一致搏动有很好的作用。
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10楼2014-04-21 10:21:42
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