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[交流]
成年SD大鼠脊髓背角神经元原代培养中,如何有效分离得到形态活力好的神经元
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虫友们,大家好。最近在做关于成年SD大鼠脊髓背角神经元原代培养。在实验的过程中遇到了些问题,想请教虫友们,请高手不吝赐教,多谢了! 先简单说一下我的protocol,材料:2 weeks SD大鼠;取材:戊巴比妥钠麻醉,小心解开脊髓腔,取出脊髓彭大部分,放至到冰冻的过滤除菌的ACSF中,剥离软脊膜,将脊髓移入4%FBS+DPBS中,剪刀剪碎。消化过程:先用DPBS洗两遍,用37℃ 0.125%Trypsin/EDTA消化2分钟,10%FBS终止消化。用1ml移液枪轻柔吹打脊髓,吹打过冲中添加0.1mg/ml DNase I。待溶液稍浑浊,静止,接种于24孔板,放至于37℃ CO2 incubator。 虫友们看一下我的protocol有没有严重理论错误?我的问题是,接种2天后换液,第三天能看到少量活的神经元和胶质细胞,但胞体较脏,胞体不知附着什么类似于组织碎片的东西,达不到试验要求。并且24孔板底部有大量组织碎片贴在孔底部,导致背景较脏。第五天后神经元就死亡了,坚持不了几天。 如何能使组织碎片较少,如何使细胞胞体干净通透?是从消化过程改进还是吹打方法上改进?请大家积极回帖,高手们不吝赐教。如果有较好的方法学文献更好了,我的金币不多,就100个金币,还请大家详细说说如何改进,谢谢! [ Last edited by chancety on 2013-11-6 at 20:42 ] |
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