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chancety

金虫 (小有名气)

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虫号: 2029955

[交流] 成年SD大鼠脊髓背角神经元原代培养中，如何有效分离得到形态活力好的神经元

虫友们，大家好。最近在做关于成年SD大鼠脊髓背角神经元原代培养。在实验的过程中遇到了些问题，想请教虫友们，请高手不吝赐教，多谢了！
先简单说一下我的protocol，材料：2 weeks SD大鼠；取材：戊巴比妥钠麻醉，小心解开脊髓腔，取出脊髓彭大部分，放至到冰冻的过滤除菌的ACSF中，剥离软脊膜，将脊髓移入4%FBS+DPBS中，剪刀剪碎。消化过程：先用DPBS洗两遍，用37℃ 0.125%Trypsin/EDTA消化2分钟，10%FBS终止消化。用1ml移液枪轻柔吹打脊髓，吹打过冲中添加0.1mg/ml DNase I。待溶液稍浑浊，静止，接种于24孔板，放至于37℃ CO2 incubator。
虫友们看一下我的protocol有没有严重理论错误？我的问题是，接种2天后换液，第三天能看到少量活的神经元和胶质细胞，但胞体较脏，胞体不知附着什么类似于组织碎片的东西，达不到试验要求。并且24孔板底部有大量组织碎片贴在孔底部，导致背景较脏。第五天后神经元就死亡了，坚持不了几天。
如何能使组织碎片较少，如何使细胞胞体干净通透？是从消化过程改进还是吹打方法上改进？请大家积极回帖，高手们不吝赐教。如果有较好的方法学文献更好了，我的金币不多，就100个金币，还请大家详细说说如何改进，谢谢！

[ Last edited by chancety on 2013-11-6 at 20:42 ]

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