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湘云紫

银虫 (初入文坛)

[交流] 心肌细胞培养交流

以下是我的实验步骤
1. 2-4天大鼠乳鼠酒精浸泡15秒，取心，置于有4度pbs的培养皿中，用pbs清洗2遍
2. 剔除心脏周围的血凝及纤维组织，抽取5ml胰酶，少量放入50ml烧杯中，大部分（留点冲洗）倒入50ml离心管，将心脏放入小烧杯剪碎，倒入50ml离心管，用剩余的胰酶冲洗一遍。
3. 消化：将含有心肌的50ml的离心管放入34℃的水浴锅中10min，轻轻晃动数次。第一次消化液弃去。以后消化为8分钟（中间摇晃几次）。
4. 离心：补加3ml 胰酶入2步骤中的离心管，继续消化。第二次以后的消化液轻轻吹打，自然沉淀，各取2ml上清放入2 只（1,2号）离心管，再各加入2mlDMEM离心8分钟（1000转）。离心好的1,2号离心管，弃上清，加1mlDMEM重悬，收集于一只15ml离心管中。
5. 重复消化和离心。将所有离心过的细胞重悬后收集于离心管，再次离心8分钟，弃上清，加入含有20%胎牛血清、双抗、brdu的DMEM 4ml，重悬，过100、200目不锈钢筛网。
6. 过筛后的细胞液放入细胞瓶，90min差数贴壁。调整细胞浓度500000个每毫升。种于24孔板中。我6只大鼠乳鼠心脏种了6孔。24小时换液，此后隔日换液。

结果：
离心后细胞数目较多，细胞小而圆。
24小时换液后，细胞数目明显减少，贴壁细胞稀疏，小而圆，部分会抖动。
48小时观察，细胞小，量少，不动


交流：
第一次换液，48小时会不会好一点？
我的细胞24小时的时候都是圆的是怎么回事？
有没有哪位高人有成熟的心肌细胞培养方法？？
胶原酶好贵啊。。真心用不起诶。。。哭。。。
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1楼 2011-12-30 20:48:49
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重阳节节

新虫 (初入文坛)
★ ★
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yqbter: 金币+1, 鼓励发帖！ 2012-06-24 01:29:19
你这到最后一步才终止消化，细胞早就被消化死了。在离心以前就要加入胎牛血清，终止消化。你的操作有太多的问题，建议多看一点关于心肌细胞培养的文章。
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3楼2012-06-23 19:00:45
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446046295

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的培养基都加哪些东西啊？除了双抗和血清需要加非必须氨基酸和谷氨酰胺么？
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4楼2012-11-21 16:43:02
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几音

金虫 (初入文坛)
★
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胰酶消化那么长时间对细胞损伤会很大吧，另外24小时换培养液是不是早了点？导致很多心肌细胞随着换液流失。
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5楼2013-03-19 10:21:14
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liboliu2007

新虫 (初入文坛)
★
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我用的MP的胶原酶100mg粉末不到300块，能配好多啊。
此外楼主用的血清要好一些的啊，最好加用促生长因子。养原代心肌细胞就是噩梦。
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6楼2014-04-21 10:33:54
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湘云紫2楼
2011-12-30 20:54   回复  
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