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[交流]
【求助/交流】请教肺泡巨噬细胞的提取与培养,中性红法吞噬功能检测
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我提的AM细胞经常生长状态不好,方法是将预冷的PBS进行肺灌洗,灌洗液1000r/min离心10min,弃上清,留下层细胞沉淀,再用PBS重新悬浮细胞,洗涤3次。用含10%小牛血清的RPM1640细胞培养液重悬细胞,制成单细胞悬液,分于培养瓶中,培养液3.0ml,在CO2细胞培养箱(37℃,5%CO2)中孵育2h使之贴壁生长,弃上清,用PBS洗板2次去除未贴壁细胞,重新加入含10%胎牛血清的RPM1640培养基,继续放入培养箱内培养,2~3天更换培养液。 问题是:2h后洗瓶时总是发现细胞贴壁状态不好,悬浮细胞比较多,一洗就洗出来了(我洗时只是用PBS晃了晃,没有吹),有一次想试试看让它多孵育点时间再洗会不会贴的更好,结果连贴壁细胞也悬起来了。后来就孵育2h后必洗,但是有时2h后贴的还可以,洗完换了液后孵育十几个小时,又悬浮了。我听说AM贴壁状态特别好,很难消下来。我提取的细胞贴壁不好是不是说明生长状态就不好呢。我提了很多次了,分析了原因,可是总是这样。请教有没有注意事项没考虑到,还是方法有问题? 中性红吞噬试验也有问题。我的配制方法是:1、用含10%FBS的RPM1640培养液配制0.1%的中性红,充分搅拌。2、37摄氏度水浴过夜,过滤(整个过程中避光)。过滤后颜色很浅,就像培养液颜色一样。 实验步骤:2.0×10^6个/ml的细胞悬液200μl接种于96孔板,孵育24h后换200μl纳米颗粒染毒悬液,继续孵育24h,弃旧液,PBS洗板两次以尽量洗去残留的颗粒。加入200μl中性红(中性红是现用现配)孵育3h,PBS洗板3次加入裂解液(冰乙酸:无水乙醇=1:1),避光静置12h,550nm波长测吸光度值。 可是结果不理想,吸光度值都差不多,而且特别小,才0.08左右,不知哪里出了问题。 |
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肺泡巨噬 |
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