[交流] 【求助/交流】请教肺泡巨噬细胞的提取与培养，中性红法吞噬功能检测

我提的AM细胞经常生长状态不好,方法是将预冷的PBS进行肺灌洗，灌洗液1000r/min离心10min,弃上清，留下层细胞沉淀，再用PBS重新悬浮细胞，洗涤3次。用含10%小牛血清的RPM1640细胞培养液重悬细胞，制成单细胞悬液，分于培养瓶中，培养液3.0ml，在CO2细胞培养箱（37℃，5%CO2）中孵育2h使之贴壁生长，弃上清，用PBS洗板2次去除未贴壁细胞，重新加入含10%胎牛血清的RPM1640培养基，继续放入培养箱内培养，2～3天更换培养液。
问题是：2h后洗瓶时总是发现细胞贴壁状态不好，悬浮细胞比较多，一洗就洗出来了（我洗时只是用PBS晃了晃，没有吹），有一次想试试看让它多孵育点时间再洗会不会贴的更好，结果连贴壁细胞也悬起来了。后来就孵育2h后必洗，但是有时2h后贴的还可以，洗完换了液后孵育十几个小时，又悬浮了。我听说AM贴壁状态特别好，很难消下来。我提取的细胞贴壁不好是不是说明生长状态就不好呢。我提了很多次了，分析了原因，可是总是这样。请教有没有注意事项没考虑到，还是方法有问题？
中性红吞噬试验也有问题。我的配制方法是：1、用含10%FBS的RPM1640培养液配制0.1%的中性红，充分搅拌。2、37摄氏度水浴过夜，过滤（整个过程中避光）。过滤后颜色很浅，就像培养液颜色一样。
实验步骤：2.0×10^6个/ml的细胞悬液200μl接种于96孔板，孵育24h后换200μl纳米颗粒染毒悬液，继续孵育24h,弃旧液，PBS洗板两次以尽量洗去残留的颗粒。加入200μl中性红（中性红是现用现配）孵育3h，PBS洗板3次加入裂解液（冰乙酸：无水乙醇=1:1），避光静置12h，550nm波长测吸光度值。
可是结果不理想，吸光度值都差不多，而且特别小，才0.08左右，不知哪里出了问题。

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