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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教肺泡巨噬细胞的提取与培养，中性红法吞噬功能检测
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huchuanlu5

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教肺泡巨噬细胞的提取与培养，中性红法吞噬功能检测

我提的AM细胞经常生长状态不好,方法是将预冷的PBS进行肺灌洗，灌洗液1000r/min离心10min,弃上清，留下层细胞沉淀，再用PBS重新悬浮细胞，洗涤3次。用含10%小牛血清的RPM1640细胞培养液重悬细胞，制成单细胞悬液，分于培养瓶中，培养液3.0ml，在CO2细胞培养箱（37℃，5%CO2）中孵育2h使之贴壁生长，弃上清，用PBS洗板2次去除未贴壁细胞，重新加入含10%胎牛血清的RPM1640培养基，继续放入培养箱内培养，2～3天更换培养液。
问题是：2h后洗瓶时总是发现细胞贴壁状态不好，悬浮细胞比较多，一洗就洗出来了（我洗时只是用PBS晃了晃，没有吹），有一次想试试看让它多孵育点时间再洗会不会贴的更好，结果连贴壁细胞也悬起来了。后来就孵育2h后必洗，但是有时2h后贴的还可以，洗完换了液后孵育十几个小时，又悬浮了。我听说AM贴壁状态特别好，很难消下来。我提取的细胞贴壁不好是不是说明生长状态就不好呢。我提了很多次了，分析了原因，可是总是这样。请教有没有注意事项没考虑到，还是方法有问题？
中性红吞噬试验也有问题。我的配制方法是：1、用含10%FBS的RPM1640培养液配制0.1%的中性红，充分搅拌。2、37摄氏度水浴过夜，过滤（整个过程中避光）。过滤后颜色很浅，就像培养液颜色一样。
实验步骤：2.0×10^6个/ml的细胞悬液200μl接种于96孔板，孵育24h后换200μl纳米颗粒染毒悬液，继续孵育24h,弃旧液，PBS洗板两次以尽量洗去残留的颗粒。加入200μl中性红（中性红是现用现配）孵育3h，PBS洗板3次加入裂解液（冰乙酸：无水乙醇=1:1），避光静置12h，550nm波长测吸光度值。
可是结果不理想，吸光度值都差不多，而且特别小，才0.08左右，不知哪里出了问题。
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1楼 2010-11-29 17:04:07
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wym901116

新虫 (初入文坛)
★ ★
huchuanlu5(金币+1): 谢谢参与
huchuanlu5(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-11 08:21:22
第一次用含10%小牛血清的RPM1640细胞培养液重悬细胞时，加入2mmol/L的谷氨酰胺，100u/L的青霉素，100u/L的链霉素
赞一下 回复此楼
5楼2013-02-26 19:58:12
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huchuanlu5

银虫 (小有名气)
继续请教各位大侠帮忙
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2楼2010-12-01 18:43:23
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prtong

金虫 (正式写手)
★ ★
huchuanlu5(金币+1): 谢谢参与
huchuanlu5(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:21:33
我觉得你的培养液可能不行，不适合肺巨噬细胞的培养。换下进口血清，和DMEM培养液试试，看看贴壁效果是否好一点！
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6楼2013-04-10 21:21:49
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chenweijlu

铜虫 (小有名气)
★
huchuanlu5(金币+1): 谢谢参与
中性红过滤后颜色没那么浅吧
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7楼2014-01-08 17:59:14
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wdxmu10楼
2017-09-17 16:50   回复  
huchuanlu5(金币+1): 谢谢参与
一 发自小木虫IOS客户端
wdxmu11楼
2017-09-17 16:50   回复  
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