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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于Cloning的问题，求救啊~~
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seo.d_park

木虫 (正式写手)

[求助] 关于Cloning的问题，求救啊~~ 已有5人参与

我在做的cloning，
我的几个mutant...Ligation,enzyme cutting 确认, sequencing, Protein expression这些都没有问题。
所以准备做Maxi prep来大量提取DNA。
但是问题就出在这儿。
之前的步骤一直是拿取的colony 在4ml LB broth培养(3ml培养，1ml做了Stock)后，Mini prep提取的DNA做的。
然后确定DNA没问题后，拿stock做 Maxi prep。
(stock是 菌液：DMSO=4:1 制作的 500ul,然后放入-80℃的freezer 冷冻保管。)
在做Maxi 时候（确认培养液浑浊后），取少量(3ml)又用restriction enzyme 切了一遍，发现没有之前(Colony提取的DNA) Insert band 明显(DNA量加到2ug才能隐约看到Insert  band,有几个根本看不到，之前用1ug 就能看到明显的insert band，我所做的Insert size 是200~700bp，restriction enzyme 前后端一起切的,用的是takara的，1ug/1ug）。
然后继续确认了Protein expression，与之前一样用了1ug 进行了transfection,但是没有出现Band。
所以我又疑惑把Maxi prep提取的DNA切了一遍，insert这次根本切不掉了。
这到底是什么问题啊。。
不可能是在培养过程中变异或者在freezer里面变异了吧。。。
求解啊~~上面的图是1ug cutting,下面的是2ug...
关于Cloning的问题，求救啊~~
colony cutting(下面的Band).jpg


关于Cloning的问题，求救啊~~-1
stock cutting(下数第二个band).jpg
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1楼 2014-02-21 17:59:17
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seo.d_park: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 嗯~谢谢！我重新做试试。 2014-02-23 14:21:32
推测楼主是保存了一个甘油菌（stock）。然后用stock重新活化，发现与原来结果有出入（digestion, expression）。个人意见，要是这样的话，何不重新做一遍（转化）？挑斑－>检测。
赞一下(1人) 回复此楼
活着就要让人感受到你的存在。
9楼2014-02-22 22:22:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
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