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关于TAKARA的RT-PCR试剂盒说明书~ 已有3人参与
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最近买了TAKARA的RT-PCR试剂盒，RR014A，说明书倒是很详细，但还是有地方不太明白，希望有用过的前辈指点指点啊~~ 1 反转录前有个变性退火的过程，65℃ 5 min，接着有个4℃，但没说多长时间，是怎么个意思呢？加了反转录酶后的延伸部分也有 同样的问题，只有4℃，没有多长时间~ 2 试剂盒里面带的三个反转录引物，Oligo dT Primer，Random 6 mers和Specific Primer，做未知基因的话，前两个之中哪个好一点呢？ 3 还有就是PCR部分说明书上写了两步法和三步法，这又是怎么回事？一般不是只有一步法和两步法吗，三步法是什么意思？ |
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cicelyzh
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4楼2013-12-28 07:09:30
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1.4℃是产物保存的温度，4℃前的反应已经结束啦，可以收了。仪器上4℃这步你可以设成无穷大，或者24小时之类的，万一没有及时收，产物在4℃下也能存很久。 2. Specific Primer是针对已知基因专门设计的，试剂盒上应该是没有的哦。 你的是未知基因，Oligo dT Primer和Random 6 mers建议一起用，更容易获得全长的RNA。 3.“PCR部分说明书上写了两步法和三步法”这个是针对PCR程序说的。这里的两步是指退火和延伸用同一个温度，三步则是传统PCR的变性、退火、延伸都用不同温度。两步法因为不用变化温度，PCR耗时相对较短；三步法则可以有效提高反应的特异性和扩增效率。时间充裕的话还是用三步法吧。 你说的一步法和两步法指的是反转录和定量PCR这两个过程是不是在一起。通俗地说，如果你先做反转录，然后取cDNA出来再做定量PCR，这个叫做两步法；如果你一次性把反转录和定量PCR的东西都加到一个管子里，反转录之后不开盖，直接做定量PCR，这个叫做一步法（不是所有试剂盒都能用一步法的哈，不清楚时别乱来  ）。一步法比较省事，而且不开盖可以降低污染几率，但是反转录出来的cDNA只能用一次，适合土豪；两步法的话比较省东西，得到的cDNA可以多次使用。我建议你用两步法。 |
2楼2013-12-27 22:21:48
冷雁孤旅
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3楼2013-12-27 22:50:04
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