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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liangpz: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2013-12-28 09:52:14
myprayer: 金币+5, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-28 11:42:55

1.4℃是产物保存的温度，4℃前的反应已经结束啦，可以收了。仪器上4℃这步你可以设成无穷大，或者24小时之类的，万一没有及时收，产物在4℃下也能存很久。
2. Specific Primer是针对已知基因专门设计的，试剂盒上应该是没有的哦。你的是未知基因，Oligo dT Primer和Random 6 mers建议一起用，更容易获得全长的RNA。
3.“PCR部分说明书上写了两步法和三步法”这个是针对PCR程序说的。这里的两步是指退火和延伸用同一个温度，三步则是传统PCR的变性、退火、延伸都用不同温度。两步法因为不用变化温度，PCR耗时相对较短；三步法则可以有效提高反应的特异性和扩增效率。时间充裕的话还是用三步法吧。

你说的一步法和两步法指的是反转录和定量PCR这两个过程是不是在一起。通俗地说，如果你先做反转录，然后取cDNA出来再做定量PCR，这个叫做两步法；如果你一次性把反转录和定量PCR的东西都加到一个管子里，反转录之后不开盖，直接做定量PCR，这个叫做一步法（不是所有试剂盒都能用一步法的哈，不清楚时别乱来

）。一步法比较省事，而且不开盖可以降低污染几率，但是反转录出来的cDNA只能用一次，适合土豪；两步法的话比较省东西，得到的cDNA可以多次使用。我建议你用两步法。