小弟在构建一质粒，遇到一奇怪现象求大家指教。目的基因全长1700左右。上下游酶切位点分别为HindIII和EcoRI,其中序列包含有两个BamHI酶切位点，可以将序列分为270,900,500三个片段。载体构建完成后进行酶切验证出现了问题如图。我选了两个单克隆提质粒酶切。左边第一个为全长酶切H/E(片段理论大小为1700bp),第2个为H/B酶切(理论应得片段为270,900)，第3个为B/E酶切（理论得到片断为900,500）。接下来三个为另一个相同的单克隆试验方法与前三个一一对应。Marker自上而下分别为2000， 1000， 750,500,250,100.同时我又做了PCR验证。选用通用正向引物与270片段的反向引物扩增（通用引物位于插入位点上有200左右，理论得到片段为470），电泳为Markeri右边第一个。选用通用反向引物和500片段正向引物PCR（反向引物位于插入位点下游100左右，理论得到片断为600），电泳图为Marker右边第2个。另一单克隆相同实验电泳图为Marker右边3和4 。测序没办法用通用引物，用扩增全长引物测序显示，序列除了开头和结尾分别有15个碱基不确定外其它地方没有问题。但是对于这张图百思不得其解，求解释。![载体构建中遇到的奇怪现象]()
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