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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建中遇到的奇怪现象
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0616102018

木虫 (小有名气)

[交流] 载体构建中遇到的奇怪现象

小弟在构建一质粒，遇到一奇怪现象求大家指教。目的基因全长1700左右。上下游酶切位点分别为HindIII和EcoRI,其中序列包含有两个BamHI酶切位点，可以将序列分为270,900,500三个片段。载体构建完成后进行酶切验证出现了问题如图。我选了两个单克隆提质粒酶切。左边第一个为全长酶切H/E(片段理论大小为1700bp),第2个为H/B酶切(理论应得片段为270,900)，第3个为B/E酶切（理论得到片断为900,500）。接下来三个为另一个相同的单克隆试验方法与前三个一一对应。Marker自上而下分别为2000， 1000， 750,500,250,100.同时我又做了PCR验证。选用通用正向引物与270片段的反向引物扩增（通用引物位于插入位点上有200左右，理论得到片段为470），电泳为Markeri右边第一个。选用通用反向引物和500片段正向引物PCR（反向引物位于插入位点下游100左右，理论得到片断为600），电泳图为Marker右边第2个。另一单克隆相同实验电泳图为Marker右边3和4 。测序没办法用通用引物，用扩增全长引物测序显示，序列除了开头和结尾分别有15个碱基不确定外其它地方没有问题。但是对于这张图百思不得其解，求解释。载体构建中遇到的奇怪现象
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    • 2013-12-16 15:12:22, 147.92 K

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1楼 2013-12-16 15:13:25
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天猫天猫

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-16 22:02:00
从照片看，所提取的质粒DNA质量不好，混入过多的核基因组DNA，且酶切不充分。酶切不充分也可能是质粒DNA质量不高引起的。建议重提质粒
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2楼2013-12-16 15:22:21
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0616102018

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天猫天猫 at 2013-12-16 15:22:21
从照片看，所提取的质粒DNA质量不好，混入过多的核基因组DNA，且酶切不充分。酶切不充分也可能是质粒DNA质量不高引起的。建议重提质粒

第二个单克隆酶切是不充分，但是第一个质粒应该酶切的挺好的。求解释！！！
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3楼2013-12-16 15:27:23
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:54:01
质粒酶切不完全。
如果是高拷贝质粒，建议少加点。
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4楼2013-12-17 12:28:16
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★ ★
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0616102018: 金币+1 2013-12-20 16:06:02
引用回帖:
3楼: Originally posted by 0616102018 at 2013-12-16 15:27:23
第二个单克隆酶切是不充分，但是第一个质粒应该酶切的挺好的。求解释！！！...

第一个质粒，你认为酶切挺好的？除了目的条带外，上面那么大一坨都是未切开的。
总之，质粒提取质量不高，严重影响酶切反应。
不过，好在，PCR鉴定能说明问题。
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5楼2013-12-17 12:32:20
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湖畔狂想

金虫 (小有名气)
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0616102018: 金币+1 2013-12-20 16:05:57
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:54:10
你左边第1个切下来的也不是1700啊。
左边第3个中第2条带倒是有点像1700的样子。
左边第1个切开了，但是不是1700，这有可能是你提的质粒中有其他DNA，你切的质粒不是你的需要切的质粒造成的。
而且你左边6个孔上都有亮带，质粒提的质量不是很好。
建议先把质粒提好，再酶切。
提质粒时，离心完一定要注意把离心管中的残余液吸干。
希望能对你有帮助。
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6楼2013-12-19 08:50:12
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