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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pma0911重组载体转枯草芽孢杆菌wb600
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宋晨萌1992

铜虫 (初入文坛)

[求助] pma0911重组载体转枯草芽孢杆菌wb600 已有1人参与

转化枯草wb600 一个多月了 用的方法是师兄之前用过的成功了，宿主菌是师兄给的相同的，载体也一样都是pma0911 目的基因比师兄的大800bp转化了好久都不成，师兄也不明原因 方法如下，求大神指导

枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
L．试剂
SPI－I Salts Solution：（500g Solution）
0.4％      (NH4)2SO4                                                                   0.2g
2.8%      K2HPO4•3H2O                                                  1.4g
1.2%      KH2PO4                                                                       0.6g
0.2%      Trisodium Citrate Dihydrate                0.1g
121℃灭菌20min

SPI－II Salts Solution：（500g Solution）
0.04%    MgSO4•7H2O                          0.02g
121℃灭菌20min

100× CAYE Solution：（100g Solution）
2％         Casamino acid                           2g
10％       Yeast Extract                             10g
121℃灭菌20min


SPI Medium：（20mL）
9.8mL    SPI－I Salts Solution
9.8mL    SPI－II Salts Solution
200μL （1％V）Glucose（50％W，115℃灭菌20min）
200μL （1％V）100× CAYE

SPII Medium：（6mL）
5.88mL SPI Medium
60μL （1％V）50mM CaCl2
60μL （1％V）250mM MgCl2

100×EGTA Solution：10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0


2 工具：（以下物品均需灭菌）
50mL离心管，1.5mL离心管，5mL枪头，1mL枪头 ，200μL枪头，20μL枪头，空的10mL试管，纱布，涂布棒

3 方法
1、 前一天晚上挑取宿主菌接种于3mL 液体培养基中，37℃摇床培养过夜。
2、 第二天早上从过夜培养物中取100μL菌液，接种至用50mL 离心管配好的5mL SPI Medium中，37℃摇床培养，3hr后开始测OD 600，当培养物生长到对数末期时约4.5小时，快速取200μL接种到2mL SPII Medium中，于37℃100rpm摇床培养1.5hr。
3、 加20μL 100×EGTA溶液，于37℃100rpm摇床培养10min，用1.5mL离心管分装成500μL每管。
4、 向管中加入适量的质粒，轻轻混匀于37℃100rpm摇床培养30min。
5、 将离心管转移到250rpm摇床，37℃培养1.5hr。
6、 以4000rpm离心收集菌体，弃部分上清液，留100μL重悬菌体，涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。

试剂原因也考虑过了，重新配了试剂，应该没有问题了
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1楼 2013-12-08 11:02:45
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xissy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不知道，你注意没有，SPI和SPII对应的质量都小了一个小数点。
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2楼2014-03-17 21:21:34
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宋晨萌1992

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xissy at 2014-03-17 21:21:34
不知道，你注意没有，SPI和SPII对应的质量都小了一个小数点。

谢谢 就是这个原因
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3楼2014-05-27 18:08:34
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我又当如何

新虫 (小有名气)
你好，我小硕一枚，请问您有pma0911质粒的碱基图谱吗？
赞一下 回复此楼
4楼2018-05-17 21:49:18
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农大沐心

新虫 (初入文坛)
楼主，请问50%W的葡萄糖怎么配？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2018-06-24 13:43:07
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小舍的密码

禁虫 (初入文坛)
★
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-07-10 05:47:45
本帖内容被屏蔽
6楼2018-07-10 00:43:15
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