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宋晨萌1992

铜虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 115.6
帖子: 24
在线: 11.2小时
虫号: 2715641
注册: 2013-10-11
性别: MM
专业: 生物化学

[求助] pma0911重组载体转枯草芽孢杆菌wb600 已有1人参与

转化枯草wb600 一个多月了用的方法是师兄之前用过的成功了，宿主菌是师兄给的相同的，载体也一样都是pma0911 目的基因比师兄的大800bp转化了好久都不成，师兄也不明原因方法如下，求大神指导

枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
L．试剂
SPI－I Salts Solution：（500g Solution）
0.4％    (NH4)2SO4                                                                0.2g
2.8%    K2HPO4•3H2O                                                 1.4g
1.2%    KH2PO4                                                                      0.6g
0.2%    Trisodium Citrate Dihydrate             0.1g
121℃灭菌20min

SPI－II Salts Solution：（500g Solution）
0.04% MgSO4•7H2O                         0.02g
121℃灭菌20min

100× CAYE Solution：（100g Solution）
2％       Casamino acid                         2g
10％    Yeast Extract                            10g
121℃灭菌20min

SPI Medium：（20mL）
9.8mL SPI－I Salts Solution
9.8mL SPI－II Salts Solution
200μL （1％V）Glucose（50％W，115℃灭菌20min）
200μL （1％V）100× CAYE

SPII Medium：（6mL）
5.88mL SPI Medium
60μL （1％V）50mM CaCl2
60μL （1％V）250mM MgCl2

100×EGTA Solution：10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0

2 工具：（以下物品均需灭菌）
50mL离心管，1.5mL离心管，5mL枪头，1mL枪头，200μL枪头，20μL枪头，空的10mL试管，纱布，涂布棒

3 方法
1、前一天晚上挑取宿主菌接种于3mL 液体培养基中，37℃摇床培养过夜。
2、第二天早上从过夜培养物中取100μL菌液，接种至用50mL 离心管配好的5mL SPI Medium中，37℃摇床培养，3hr后开始测OD 600，当培养物生长到对数末期时约4.5小时，快速取200μL接种到2mL SPII Medium中，于37℃100rpm摇床培养1.5hr。
3、加20μL 100×EGTA溶液，于37℃100rpm摇床培养10min，用1.5mL离心管分装成500μL每管。
4、向管中加入适量的质粒，轻轻混匀于37℃100rpm摇床培养30min。
5、将离心管转移到250rpm摇床，37℃培养1.5hr。
6、以4000rpm离心收集菌体，弃部分上清液，留100μL重悬菌体，涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。

试剂原因也考虑过了，重新配了试剂，应该没有问题了