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pma0911重组载体转枯草芽孢杆菌wb600 已有1人参与
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转化枯草wb600 一个多月了 用的方法是师兄之前用过的成功了，宿主菌是师兄给的相同的，载体也一样都是pma0911 目的基因比师兄的大800bp转化了好久都不成，师兄也不明原因 方法如下，求大神指导 枯草杆菌化学感受态制备及转化方法 L．试剂 SPI－I Salts Solution：（500g Solution） 0.4％ (NH4)2SO4 0.2g 2.8% K2HPO4•3H2O 1.4g 1.2% KH2PO4 0.6g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 0.1g 121℃灭菌20min SPI－II Salts Solution：（500g Solution） 0.04% MgSO4•7H2O 0.02g 121℃灭菌20min 100× CAYE Solution：（100g Solution） 2％ Casamino acid 2g 10％ Yeast Extract 10g 121℃灭菌20min SPI Medium：（20mL） 9.8mL SPI－I Salts Solution 9.8mL SPI－II Salts Solution 200μL （1％V）Glucose（50％W，115℃灭菌20min） 200μL （1％V）100× CAYE SPII Medium：（6mL） 5.88mL SPI Medium 60μL （1％V）50mM CaCl2 60μL （1％V）250mM MgCl2 100×EGTA Solution：10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 2 工具：（以下物品均需灭菌） 50mL离心管，1.5mL离心管，5mL枪头，1mL枪头 ，200μL枪头，20μL枪头，空的10mL试管，纱布，涂布棒 3 方法 1、 前一天晚上挑取宿主菌接种于3mL 液体培养基中，37℃摇床培养过夜。 2、 第二天早上从过夜培养物中取100μL菌液，接种至用50mL 离心管配好的5mL SPI Medium中，37℃摇床培养，3hr后开始测OD 600，当培养物生长到对数末期时约4.5小时，快速取200μL接种到2mL SPII Medium中，于37℃100rpm摇床培养1.5hr。 3、 加20μL 100×EGTA溶液，于37℃100rpm摇床培养10min，用1.5mL离心管分装成500μL每管。 4、 向管中加入适量的质粒，轻轻混匀于37℃100rpm摇床培养30min。 5、 将离心管转移到250rpm摇床，37℃培养1.5hr。 6、 以4000rpm离心收集菌体，弃部分上清液，留100μL重悬菌体，涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。 试剂原因也考虑过了，重新配了试剂，应该没有问题了  |
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