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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 质量控制 » HPLC测含量摸索流动相的问题
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王文静341

新虫 (初入文坛)

[交流] HPLC测含量摸索流动相的问题

求助：HPLC同时测定复方中两种成分，分别是碱性物质和酸性物质，用过甲醇/乙腈-酸水、乙腈-磷酸盐流动相，但分离效果不好，请问流动相我接下来该采用什么思路摸索，哪位大神给建议，万分感激！
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1楼2013-12-06 10:30:58
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1845221

木虫 (小有名气)
楼主啊，方法开发不是在流动相上下功夫，你要在色谱柱上进行筛选。你一个酸性一个碱性，建议你尝试一下HILIC-NH2柱，例如waters XBridge Amide的柱子，不要老想着用反相进行分离或者加啥离子对，搞的太复杂了，调整思路吧！
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14楼2013-12-06 18:41:32
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普通回帖

痴夷子皮

版主 (文坛精英)
★
王文静341: 金币+1 2013-12-06 16:41:00
乙腈-磷酸盐流动相，加点磷酸调一下pH试试看。酸性、碱性物质，调pH是比较好的选择，不行再试试梯度。
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2楼2013-12-06 10:39:42
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helious

银虫 (小有名气)
★
王文静341: 金币+1 2013-12-06 16:41:49
你用的这两种物质是不是极性特别大啊，如果是的话就得在色谱柱上下功夫了，换个氨基柱估计会好点，方法上估计没什么突破，一般也就是缓冲盐-甲醇梯度洗脱
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3楼2013-12-06 10:43:00
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顾莫柔

金虫 (正式写手)
★
王文静341: 金币+1 2013-12-06 16:41:27
首先，楼主的酸性物质和碱性物质极性相差有多大？
极性大，可考虑氨基柱；
不大，可直接用磷酸盐缓冲液（PH4.0至6.5)-乙腈。
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4楼2013-12-06 10:53:45
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星海慧儿

荣誉版主 (职业作家)
★
王文静341: 金币+1 2013-12-06 16:41:39
如果你用的是常规色谱柱的话，可能要好好摸索一下流动相的pH值，这个对酸碱物质的保留时间有影响。你可以结合物质的pKa，先调节pH保证一个呈分析态走一个试试，还可以试试梯度。
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5楼2013-12-06 11:28:00
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头头

木虫 (正式写手)
★
王文静341: 金币+1 2013-12-06 16:41:33
可以考虑用下离子对试剂，对碱性化合物的保留有帮助
不过离子对试剂对柱子伤害比较大，最好专柱专用
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6楼2013-12-06 14:30:14
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 顾莫柔 at 2013-12-06 10:53:45
首先，楼主的酸性物质和碱性物质极性相差有多大？
极性大，可考虑氨基柱；
不大，可直接用磷酸盐缓冲液（PH4.0至6.5)-乙腈。

太感谢了，一个pKa5，另一个是11，极性不大吧，生物碱和苷类，再次请求指点
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7楼2013-12-06 16:35:02
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 星海慧儿 at 2013-12-06 11:28:00
如果你用的是常规色谱柱的话，可能要好好摸索一下流动相的pH值，这个对酸碱物质的保留时间有影响。你可以结合物质的pKa，先调节pH保证一个呈分析态走一个试试，还可以试试梯度。

常规的反相C18，谢谢赐教，呵呵
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8楼2013-12-06 16:37:03
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 头头 at 2013-12-06 14:30:14
可以考虑用下离子对试剂，对碱性化合物的保留有帮助
不过离子对试剂对柱子伤害比较大，最好专柱专用

那相对于梯度洗脱呢？哪个对柱子伤害更大些？谢谢亲
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9楼2013-12-06 16:38:20
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by helious at 2013-12-06 10:43:00
你用的这两种物质是不是极性特别大啊，如果是的话就得在色谱柱上下功夫了，换个氨基柱估计会好点，方法上估计没什么突破，一般也就是缓冲盐-甲醇梯度洗脱

生物碱和苷类，极性不大吧
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10楼2013-12-06 16:40:05
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 痴夷子皮 at 2013-12-06 10:39:42
乙腈-磷酸盐流动相，加点磷酸调一下pH试试看。酸性、碱性物质，调pH是比较好的选择，不行再试试梯度。

好的，受教了，谢谢
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11楼2013-12-06 16:40:51
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by helious at 2013-12-06 10:43:00
你用的这两种物质是不是极性特别大啊，如果是的话就得在色谱柱上下功夫了，换个氨基柱估计会好点，方法上估计没什么突破，一般也就是缓冲盐-甲醇梯度洗脱

还想请教个问题，是甲醇-磷酸盐和乙腈-磷酸盐作为流动相什么不同，常见是用后者，为什么呢？
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12楼2013-12-06 16:44:40
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yi_wang

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
王文静341: 金币+2 2013-12-07 19:36:06
选择秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。秘诀2： 三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 秘诀3： 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
1.流动相的性质要求
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。
2.流动相的pH值
采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
]注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂。
(三乙胺triethylamine 氨分子中的氢原子被3个乙基取代的产物。分子式(CH3CH2)3N。易挥发的无色液体，有氨的气味。熔点-114.7℃，沸点89.3℃，相对密度 0.7275(20/4℃)。溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂。三乙胺有碱性，与无机酸能生成易溶于水的盐类。可由N，N- 二乙基乙酰氨与氢化铝锂反应制取，也可用乙醇胺进行气相烷基化反应合成。用于制橡胶硫化促进剂、润湿剂和杀菌剂等，也可用作溶剂和用于合成四级铵化合物。)
在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由HH公示得知，当溶液PH值等于 2.2时，99%的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值等于2.2。
当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。
在上面两个例子中，PH=3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。
希望对你有用。
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13楼2013-12-06 17:01:32
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顾莫柔

金虫 (正式写手)
★ ★
王文静341: 金币+2 2013-12-07 18:31:45
引用回帖:
7楼: Originally posted by 王文静341 at 2013-12-06 16:35:02
太感谢了，一个pKa5，另一个是11，极性不大吧，生物碱和苷类，再次请求指点...

一个是弱碱，一个是中强碱。流动相ph 调至2.7试试。
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15楼2013-12-06 22:40:55
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News

专家顾问 (职业作家)
楼主不妨，初步设定一个色谱条件，进行1~7的pH，考察色谱峰的情况。进行pH筛选。  
采用的溶剂不要降解API，溶剂的强度不要比流动相强---避免溶剂效应。
pH选择好之后，再进行进一步的优化。
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16楼2013-12-07 08:44:27
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News

专家顾问 (职业作家)
也可以先将pH设定为2.0~2.5左右，抑制色谱柱内游离硅羟基导致的次级保留，

常规的流动相就是10mM~50mM的磷酸盐（pH2.5左右）：乙腈，先走梯度确定出峰的流动相强度，可在更改为相似强度的等度洗脱。 前提也是得保证样品在流动相中的稳定性。
含量的方法应该还好弄吧，最头大的是有关物质的方法开发。
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17楼2013-12-07 08:51:45
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henryyelei

木虫 (正式写手)
我很好奇的问下，你的复方里既有酸性物质又有碱性物质，不会反应么，你这个复方能成么，你要不要先考虑下这个
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18楼2013-12-07 10:27:38
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 顾莫柔 at 2013-12-06 22:40:55
一个是弱碱，一个是中强碱。流动相ph 调至2.7试试。...

我调的pH是3，分开了，只是中强碱有拖尾，不过这个成分特点就是拖尾，正在考虑扫尾，非常感谢
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19楼2013-12-07 18:31:34
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王文静341

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by yi_wang at 2013-12-06 17:01:32
选择秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。秘诀2： 三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量 ...

谢谢，很是受用
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20楼2013-12-07 19:35:58
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