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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR 扩增 引物可以扩增多长的模板
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ping_fiu

新虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR 扩增 引物可以扩增多长的模板

关于PCR 扩增，请问如何扩增genomic DNA，？打算从血液中提取DNA。 假设我的想要的DNA 有 5500 碱基， 怎么可以保证扩增的是需要的片段？还有一对primer可以扩增多长的模板DNA? 文献上面说设计30个左右的primer，这样能保证每个primer扩增100-200 碱基吗？ 没有做过PCR，只是查文献阶段
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1楼 2013-11-06 09:46:39
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xl_dut

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ping_fiu(amisking代发): 金币+4, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-11-06 20:55:41
ping_fiu: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-07 00:54:45
PCR扩增只要设计相应的引物，以含有所要序列的DNA样品为模板就行。因此扩增genomic DNA需要设计特定的引物，然后以所提取的genomic DNA为模板就可以了！
要确定PCR产物是所需要的片段，需要保证引物的特异性，即引物只与所需要扩增的目的片段结合。此外，需要保证引物的退火温度在适当的范围，同时避免引物产生二级结构或形成引物二聚体。引物也不宜过长一般20-25bp（不包括外加的酶切位点、保护碱基等）就够。
PCR产物的长短与引物的关系不大，主要与所用DNA Polymerase 的性能、产物的GC含量及重复序列等有关。
一般来讲，2k-3k的片段，普通的DNA Polymerase都能扩增得到，使用扩增速率较快的酶甚至可以扩增出5-8k的片段，但可能引入突变位点；对于高GC含量的片段需要使用高GC含量片段需要使用的buffer；当片段中有长片段的连续的A或T时，PCR产物的长度可能会下降，如果需要得到较长的片段，建议使用与模板结合较强的酶。
如果扩增的片段较长，可以选择将片段分段p下来，然后用overlap PCR的方法把每个片段连接起来；当然也可以选择适当的酶切位点来连接。
祝实验顺利！
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一日之计在于昨天！
3楼2013-11-06 13:01:15
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 13:06:34
ping_fiu: 金币+5, 谢谢啦 2013-11-07 00:51:17
一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。：这个答案来自百度。
我们自己平时实验没扩增过超过5k的，听师姐说10k很难扩出来。要分段扩。你可以设计2段每段2.5k足可以了。
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
2楼2013-11-06 12:58:45
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ping_fiu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xl_dut at 2013-11-06 13:01:15
PCR扩增只要设计相应的引物，以含有所要序列的DNA样品为模板就行。因此扩增genomic DNA需要设计特定的引物，然后以所提取的genomic DNA为模板就可以了！
要确定PCR产物是所需要的片段，需要保证引物的特异性，即引 ...

谢谢您的信息！ 我就是不明白分段PCr， PCR 完的产物是多长呢？  分段之后 如何连接起来呢？
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4楼2013-11-07 00:54:35
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xl_dut

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ping_fiu at 2013-11-07 00:54:35
谢谢您的信息！ 我就是不明白分段PCr， PCR 完的产物是多长呢？  分段之后 如何连接起来呢？...

对于一般模板，一段PCR产物达到2-3k长度是没问题的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。
如果产物中重叠序列不多的话，可以将PCR得到的小片段通过overlap PCR的方法来连接起来，这也是一步PCR的方法。楼主可以搜一下overlap PCR的原理和方法，其主要难点在于引物的设计，其大致方法如下：
（1）设计引物，分别设计两个片段（拟定为A、B）的5'和3'两端引物（拟定为A5’、A3'；B5'、B3'），第一个片段的3’引物(A3')与第二个片段的5‘引物(B5')有一段互补的序列（20b左右）；
（2）以基因组DNA为模板，分别用A5’、A3'做PCR得到A片段，用B5'、B3'PCR得到B片段，两个反应分开来做，将的到的A、B片段回收后待用。
（3）向反应体系中加入纯化后的A、B片段及引物A5’和B3'，进行PCR反应，反应得到的大片段即为将A、B片段连接起来的大片段。纯化回收后即为所需大片段。
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一日之计在于昨天！
5楼2013-11-07 08:44:20
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