| 查看: 3969 | 回复: 4 | ||
ping_fiu新虫 (小有名气)
|
[求助]
关于PCR 扩增 引物可以扩增多长的模板
|
| 关于PCR 扩增，请问如何扩增genomic DNA，？打算从血液中提取DNA。 假设我的想要的DNA 有 5500 碱基， 怎么可以保证扩增的是需要的片段？还有一对primer可以扩增多长的模板DNA? 文献上面说设计30个左右的primer，这样能保证每个primer扩增100-200 碱基吗？ 没有做过PCR，只是查文献阶段 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有89人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 引物与模板不完全配对的结果
已经有3人回复
- PCR扩增DNA序列无条带
已经有46人回复
- 提取DNA后，PCR电泳无条带
已经有5人回复
- PCR就扩出过一次带，以后再也扩不出来，为什么，求指导
已经有6人回复
- 求助师兄师姐~有关于巢式PCR的问题~~help
已经有11人回复
- 荧光定量PCR设计了三对引物了，都扩增不出来，郁闷啊
已经有4人回复
- 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！
已经有14人回复
- RT-PCR模板问题。
已经有3人回复
- 为什么做PCR时候模板浓度高了会扩增不出目的片段？
已经有11人回复
- PCR回收产物做PCR模板，为什么扩不出来
已经有8人回复
- PCR产物继续扩增原来的片段效果会更好吗？
已经有16人回复
- PCR的引物扩增后会被降解掉吗？
已经有10人回复
- 求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
已经有5人回复
- 定量引物扩增特异性检测
已经有1人回复
- PCR扩增去除终止密码子
已经有4人回复
- 反向PCR之单引物扩增，真悲剧
已经有15人回复
- 关于PCR的非特异扩增
已经有8人回复
- PCR引物扩增的问题
已经有5人回复
- 16S PCR扩增的问题
已经有11人回复
沙门小rna
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 1117.7
- 散金: 5
- 红花: 6
- 沙发: 6
- 帖子: 644
- 在线: 76.7小时
- 虫号: 2012528
- 注册: 2012-09-19
- 专业: 病原细菌、细菌感染与宿主
2楼2013-11-06 12:58:45
xl_dut
木虫 (正式写手)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 1450.8
- 帖子: 412
- 在线: 157.4小时
- 虫号: 2048813
- 注册: 2012-10-08
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ping_fiu(amisking代发): 金币+4, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-11-06 20:55:41
ping_fiu: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-07 00:54:45
感谢参与，应助指数 +1
ping_fiu(amisking代发): 金币+4, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-11-06 20:55:41
ping_fiu: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-07 00:54:45
|
PCR扩增只要设计相应的引物，以含有所要序列的DNA样品为模板就行。因此扩增genomic DNA需要设计特定的引物，然后以所提取的genomic DNA为模板就可以了！ 要确定PCR产物是所需要的片段，需要保证引物的特异性，即引物只与所需要扩增的目的片段结合。此外，需要保证引物的退火温度在适当的范围，同时避免引物产生二级结构或形成引物二聚体。引物也不宜过长一般20-25bp（不包括外加的酶切位点、保护碱基等）就够。 PCR产物的长短与引物的关系不大，主要与所用DNA Polymerase 的性能、产物的GC含量及重复序列等有关。 一般来讲，2k-3k的片段，普通的DNA Polymerase都能扩增得到，使用扩增速率较快的酶甚至可以扩增出5-8k的片段，但可能引入突变位点；对于高GC含量的片段需要使用高GC含量片段需要使用的buffer；当片段中有长片段的连续的A或T时，PCR产物的长度可能会下降，如果需要得到较长的片段，建议使用与模板结合较强的酶。 如果扩增的片段较长，可以选择将片段分段p下来，然后用overlap PCR的方法把每个片段连接起来；当然也可以选择适当的酶切位点来连接。 祝实验顺利！ |
3楼2013-11-06 13:01:15
ping_fiu
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1110.7
- 散金: 11
- 帖子: 88
- 在线: 41.7小时
- 虫号: 1942290
- 注册: 2012-08-17
- 专业: 电化学分析
4楼2013-11-07 00:54:35
xl_dut
木虫 (正式写手)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 1450.8
- 帖子: 412
- 在线: 157.4小时
- 虫号: 2048813
- 注册: 2012-10-08
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
|
对于一般模板，一段PCR产物达到2-3k长度是没问题的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。 如果产物中重叠序列不多的话，可以将PCR得到的小片段通过overlap PCR的方法来连接起来，这也是一步PCR的方法。楼主可以搜一下overlap PCR的原理和方法，其主要难点在于引物的设计，其大致方法如下： （1）设计引物，分别设计两个片段（拟定为A、B）的5'和3'两端引物（拟定为A5’、A3'；B5'、B3'），第一个片段的3’引物(A3')与第二个片段的5‘引物(B5')有一段互补的序列（20b左右）； （2）以基因组DNA为模板，分别用A5’、A3'做PCR得到A片段，用B5'、B3'PCR得到B片段，两个反应分开来做，将的到的A、B片段回收后待用。 （3）向反应体系中加入纯化后的A、B片段及引物A5’和B3'，进行PCR反应，反应得到的大片段即为将A、B片段连接起来的大片段。纯化回收后即为所需大片段。 |
5楼2013-11-07 08:44:20
20