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细菌菌转化问题，跪求高手赐教
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拿了一株嗜麦芽窄食单胞菌单胞菌转化GFP质粒，做了三月未成功，转化的质粒上有抗氨苄，红霉素及林可霉素基因，这个菌本身就对抗生素抗性极强，三种抗生素混合浓度用到了600ug/ml，该菌才能被完全抑制，做化学转化的时候一般都不会出现克隆，试了几十次了，有一次出现了几个单菌落，但没有荧光，分析可能是超级菌突变株（每次都拿原始菌落做的感受态）。尝试过各种不同的转化条件，od，氯化钙浓度，以及含有氯化镁的培养液培养，但都没有成功。 转化步骤：挑取单菌落过夜培养，取500ul接种到50ml培养液，培养到od为0.5-0.6，冰浴至零度，取10ml，4°离心，7000r 5min，拿出后再加入4ml 预冷20mM氯化钙和30mM氯化镁混合液重悬，相同转速离心，后加入200ul 100mM氯化钙重悬，冰浴1h，加5ul质粒，冰浴30min ，42° 90s，冰浴3min，加入800ul soc培养液摇床培养或温育1h，均匀涂到到抗性平板。 该质粒是组成型表达。原始质粒是puc19，内插入GFP和三种抗生素抗性基因 |
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7楼2013-11-06 19:23:48
沙门小rna
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 1117.7
- 散金: 5
- 红花: 6
- 沙发: 6
- 帖子: 644
- 在线: 76.7小时
- 虫号: 2012528
- 注册: 2012-09-19
- 专业: 病原细菌、细菌感染与宿主
。你这个感受态的制备和我们很不一样，我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min，然后离菌4k rpm *10min，然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
2楼2013-11-06 13:05:43
3楼2013-11-06 16:44:36
4楼2013-11-06 16:51:15
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