应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌菌转化问题，跪求高手赐教
51/1返回列表
查看: 2163  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

175851279

新虫 (初入文坛)

[求助] 细菌菌转化问题，跪求高手赐教

拿了一株嗜麦芽窄食单胞菌单胞菌转化GFP质粒，做了三月未成功，转化的质粒上有抗氨苄，红霉素及林可霉素基因，这个菌本身就对抗生素抗性极强，三种抗生素混合浓度用到了600ug/ml，该菌才能被完全抑制，做化学转化的时候一般都不会出现克隆，试了几十次了，有一次出现了几个单菌落，但没有荧光，分析可能是超级菌突变株（每次都拿原始菌落做的感受态）。尝试过各种不同的转化条件，od，氯化钙浓度，以及含有氯化镁的培养液培养，但都没有成功。
转化步骤：挑取单菌落过夜培养，取500ul接种到50ml培养液，培养到od为0.5-0.6，冰浴至零度，取10ml，4°离心，7000r  5min，拿出后再加入4ml 预冷20mM氯化钙和30mM氯化镁混合液重悬，相同转速离心，后加入200ul 100mM氯化钙重悬，冰浴1h，加5ul质粒，冰浴30min ，42° 90s，冰浴3min，加入800ul soc培养液摇床培养或温育1h，均匀涂到到抗性平板。 该质粒是组成型表达。原始质粒是puc19，内插入GFP和三种抗生素抗性基因
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-06 09:14:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

175851279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-06 18:15:37
Top10,dh5α，沙门，还有其它菌都是这么制备的啊，可能和你们菌对数期早期的od600不一样？
...

我这菌有荚膜，貌似要先除去表面多糖。。。。还有就是这菌延迟期比较长。3个多小时。培养到od为0.5都要5,6个小时。。。
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-06 19:23:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 13:07:58
。你这个感受态的制备和我们很不一样，我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min，然后离菌4k rpm *10min，然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
热击的话我们42 90s，冰上2min
赞一下 回复此楼
应助之星就是我~没错。你没有看错~
2楼2013-11-06 13:05:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不喝咖啡

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以试一下电转化，但是要制备电转化感受态
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-06 16:44:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

175851279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-06 13:05:43
。你这个感受态的制备和我们很不一样，我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min，然后离菌4k rpm *10min，然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
热击的话我们42 90s，冰上2min

你们做的是什么菌？
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-06 16:51:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 8/400 2026-08-23 14:30 by KM5EcsNQRBPn
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +3 process2012 2026-08-23 4/200 2026-08-23 12:54 by huixian257
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 5/250 2026-08-23 12:09 by LR9qGULyN2ew
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +15 羊腰板 2026-08-21 16/800 2026-08-23 10:45 by process2012
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 07:41 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 00:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭