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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌菌转化问题，跪求高手赐教
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175851279

新虫 (初入文坛)

[求助] 细菌菌转化问题，跪求高手赐教

拿了一株嗜麦芽窄食单胞菌单胞菌转化GFP质粒，做了三月未成功，转化的质粒上有抗氨苄，红霉素及林可霉素基因，这个菌本身就对抗生素抗性极强，三种抗生素混合浓度用到了600ug/ml，该菌才能被完全抑制，做化学转化的时候一般都不会出现克隆，试了几十次了，有一次出现了几个单菌落，但没有荧光，分析可能是超级菌突变株（每次都拿原始菌落做的感受态）。尝试过各种不同的转化条件，od，氯化钙浓度，以及含有氯化镁的培养液培养，但都没有成功。
转化步骤：挑取单菌落过夜培养，取500ul接种到50ml培养液，培养到od为0.5-0.6，冰浴至零度，取10ml，4°离心，7000r  5min，拿出后再加入4ml 预冷20mM氯化钙和30mM氯化镁混合液重悬，相同转速离心，后加入200ul 100mM氯化钙重悬，冰浴1h，加5ul质粒，冰浴30min ，42° 90s，冰浴3min，加入800ul soc培养液摇床培养或温育1h，均匀涂到到抗性平板。 该质粒是组成型表达。原始质粒是puc19，内插入GFP和三种抗生素抗性基因
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1楼 2013-11-06 09:14:25
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175851279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-06 18:15:37
Top10,dh5α，沙门，还有其它菌都是这么制备的啊，可能和你们菌对数期早期的od600不一样？
...

我这菌有荚膜，貌似要先除去表面多糖。。。。还有就是这菌延迟期比较长。3个多小时。培养到od为0.5都要5,6个小时。。。
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7楼2013-11-06 19:23:48
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 13:07:58
。你这个感受态的制备和我们很不一样，我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min，然后离菌4k rpm *10min，然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
热击的话我们42 90s，冰上2min
赞一下 回复此楼
应助之星就是我~没错。你没有看错~
2楼2013-11-06 13:05:43
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不喝咖啡

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以试一下电转化，但是要制备电转化感受态
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3楼2013-11-06 16:44:36
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175851279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-06 13:05:43
。你这个感受态的制备和我们很不一样，我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min，然后离菌4k rpm *10min，然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
热击的话我们42 90s，冰上2min

你们做的是什么菌？
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4楼2013-11-06 16:51:15
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