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新虫 (初入文坛)

[求助] 细菌菌转化问题,跪求高手赐教

拿了一株嗜麦芽窄食单胞菌单胞菌转化GFP质粒,做了三月未成功,转化的质粒上有抗氨苄,红霉素及林可霉素基因,这个菌本身就对抗生素抗性极强,三种抗生素混合浓度用到了600ug/ml,该菌才能被完全抑制,做化学转化的时候一般都不会出现克隆,试了几十次了,有一次出现了几个单菌落,但没有荧光,分析可能是超级菌突变株(每次都拿原始菌落做的感受态)。尝试过各种不同的转化条件,od,氯化钙浓度,以及含有氯化镁的培养液培养,但都没有成功。
转化步骤:挑取单菌落过夜培养,取500ul接种到50ml培养液,培养到od为0.5-0.6,冰浴至零度,取10ml,4°离心,7000r  5min,拿出后再加入4ml 预冷20mM氯化钙和30mM氯化镁混合液重悬,相同转速离心,后加入200ul 100mM氯化钙重悬,冰浴1h,加5ul质粒,冰浴30min ,42° 90s,冰浴3min,加入800ul soc培养液摇床培养或温育1h,均匀涂到到抗性平板。 该质粒是组成型表达。原始质粒是puc19,内插入GFP和三种抗生素抗性基因
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175851279

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-06 13:05:43
。你这个感受态的制备和我们很不一样,我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min,然后离菌4k rpm *10min,然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
热击的话我们42 90s,冰上2min

你们做的是什么菌?
4楼2013-11-06 16:51:15
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-06 13:07:58
。你这个感受态的制备和我们很不一样,我们的od应该是在0.25-0.35之间啊。。。对数期早期。冰上放置30min,然后离菌4k rpm *10min,然后氯化钙洗3次。最后甘油氯化钙重悬。
热击的话我们42 90s,冰上2min
应助之星就是我~没错。你没有看错~
2楼2013-11-06 13:05:43
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不喝咖啡

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你可以试一下电转化,但是要制备电转化感受态
3楼2013-11-06 16:44:36
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175851279

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 不喝咖啡 at 2013-11-06 16:44:36
你可以试一下电转化,但是要制备电转化感受态

正在尝试电转中,第一次电转已经失败。。。
5楼2013-11-06 16:52:58
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