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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下
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jbj1001

银虫 (小有名气)

[求助] 诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下

样品是小鼠的二细胞胚胎，做GAPDH的标准曲线，出现的结果让我很困惑。用的是ABI的Arcturus® PicoPure™ RNA Isolation Kit，号称能够提取单个细胞的RNA，但由于由于收集的胚胎不多，所以提取的RNA的量还是比较少的，大约有40多ng在10ul反转录体系里面。今天做标准曲线时取了其中的3.5ul先稀释10倍到35ul，然后依次按照5倍的梯度稀释。实时定量PCR用的试剂盒是TAKARA的DRR820，机器是ABI7500。

看完附图后，我的问题是
1.        为什么625、125倍浓度的扩增曲线在一开始就出现峰，而ct值也分别只有15、25左右？
2.        我以5倍浓度的梯度稀释，为什么ct值会相差10左右？
3.        忽略掉最低两个浓度后的标准曲线slope：-12.24，Y-inter：55.271，R2：0.998，EFF%：17.551，这正常吗？
诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下
标准曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-1
最后两个浓度去掉以后的标曲.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-2
625倍浓度（最高浓度）的扩增曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-3
125倍浓度的扩增曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-4
25倍浓度的扩增曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-5
5倍浓度的扩增曲线.png
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1楼 2013-11-03 04:41:16
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匿名

用户注销 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jbj1001: 金币+10, ★有帮助 2013-11-05 00:15:34
本帖仅楼主可见
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2楼2013-11-05 00:13:13
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沙门小rna

金虫 (正式写手)
扩增效率怎么那么低呢。你体系有问题啊。ct一般18-30之间比较好。太高太低都不行。效率最好是100%但是不可能达到。但是17%太低了。刚开始就达到峰值我估摸是你非特性扩增吧。是不是引物么有选好。建议你把产物跑一个电泳看看条带是否是你要的。~
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
3楼2013-11-05 14:42:41
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jbj1001

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-05 14:42:41
扩增效率怎么那么低呢。你体系有问题啊。ct一般18-30之间比较好。太高太低都不行。效率最好是100%但是不可能达到。但是17%太低了。刚开始就达到峰值我估摸是你非特性扩增吧。是不是引物么有选好。建议你把产物跑一个 ...

产物没有跑电泳，但是溶解曲线是单峰。换了牛细胞的样品做的GAPDH标准曲线很好。这个是小鼠的GAPDH，还做了小鼠的另外一个基因的，也是和这个一样的。
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4楼2013-11-07 10:03:11
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沙门小rna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jbj1001 at 2013-11-07 10:03:11
产物没有跑电泳，但是溶解曲线是单峰。换了牛细胞的样品做的GAPDH标准曲线很好。这个是小鼠的GAPDH，还做了小鼠的另外一个基因的，也是和这个一样的。...

首先无语的结果
然后。。。。。光从现象上解释就是你一开始就有很强的荧光强度，感觉后面ct阈值相似了。是不是样本没冰上弄啊？还是什么别的原因，光看图分析是无解。
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jbj1001
应助之星就是我~没错。你没有看错~
5楼2013-11-07 10:33:59
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jbj1001

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-07 10:33:59
首先无语的结果
然后。。。。。光从现象上解释就是你一开始就有很强的荧光强度，感觉后面ct阈值相似了。是不是样本没冰上弄啊？还是什么别的原因，光看图分析是无解。...

谢谢回复，我觉得也是样品出问题了，放弃这批样品吧
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6楼2013-11-09 05:17:39
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