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jbj1001银虫 (小有名气)
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诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下
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样品是小鼠的二细胞胚胎，做GAPDH的标准曲线，出现的结果让我很困惑。用的是ABI的Arcturus® PicoPure™ RNA Isolation Kit，号称能够提取单个细胞的RNA，但由于由于收集的胚胎不多，所以提取的RNA的量还是比较少的，大约有40多ng在10ul反转录体系里面。今天做标准曲线时取了其中的3.5ul先稀释10倍到35ul，然后依次按照5倍的梯度稀释。实时定量PCR用的试剂盒是TAKARA的DRR820，机器是ABI7500。 看完附图后，我的问题是 1. 为什么625、125倍浓度的扩增曲线在一开始就出现峰，而ct值也分别只有15、25左右？ 2. 我以5倍浓度的梯度稀释，为什么ct值会相差10左右？ 3. 忽略掉最低两个浓度后的标准曲线slope：-12.24，Y-inter：55.271，R2：0.998，EFF%：17.551，这正常吗？  标准曲线.png  最后两个浓度去掉以后的标曲.png  625倍浓度（最高浓度）的扩增曲线.png  125倍浓度的扩增曲线.png  25倍浓度的扩增曲线.png  5倍浓度的扩增曲线.png |
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