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jbj1001

银虫 (小有名气)

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[求助] 诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下

样品是小鼠的二细胞胚胎，做GAPDH的标准曲线，出现的结果让我很困惑。用的是ABI的Arcturus® PicoPure™ RNA Isolation Kit，号称能够提取单个细胞的RNA，但由于由于收集的胚胎不多，所以提取的RNA的量还是比较少的，大约有40多ng在10ul反转录体系里面。今天做标准曲线时取了其中的3.5ul先稀释10倍到35ul，然后依次按照5倍的梯度稀释。实时定量PCR用的试剂盒是TAKARA的DRR820，机器是ABI7500。

看完附图后，我的问题是
1. 为什么625、125倍浓度的扩增曲线在一开始就出现峰，而ct值也分别只有15、25左右？
2. 我以5倍浓度的梯度稀释，为什么ct值会相差10左右？
3. 忽略掉最低两个浓度后的标准曲线slope：-12.24，Y-inter：55.271，R2：0.998，EFF%：17.551，这正常吗？

标准曲线.png

最后两个浓度去掉以后的标曲.png

625倍浓度（最高浓度）的扩增曲线.png

125倍浓度的扩增曲线.png

25倍浓度的扩增曲线.png

5倍浓度的扩增曲线.png

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qPCR的怪异结果已经有4人回复

1楼 2013-11-03 04:41:16

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jbj1001

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-05 14:42:41
扩增效率怎么那么低呢。你体系有问题啊。ct一般18-30之间比较好。太高太低都不行。效率最好是100%但是不可能达到。但是17%太低了。刚开始就达到峰值我估摸是你非特性扩增吧。是不是引物么有选好。建议你把产物跑一个 ...

产物没有跑电泳，但是溶解曲线是单峰。换了牛细胞的样品做的GAPDH标准曲线很好。这个是小鼠的GAPDH，还做了小鼠的另外一个基因的，也是和这个一样的。