应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下
51/1返回列表
查看: 2269  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

jbj1001

银虫 (小有名气)

[求助] 诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下

样品是小鼠的二细胞胚胎，做GAPDH的标准曲线，出现的结果让我很困惑。用的是ABI的Arcturus® PicoPure™ RNA Isolation Kit，号称能够提取单个细胞的RNA，但由于由于收集的胚胎不多，所以提取的RNA的量还是比较少的，大约有40多ng在10ul反转录体系里面。今天做标准曲线时取了其中的3.5ul先稀释10倍到35ul，然后依次按照5倍的梯度稀释。实时定量PCR用的试剂盒是TAKARA的DRR820，机器是ABI7500。

看完附图后，我的问题是
1.        为什么625、125倍浓度的扩增曲线在一开始就出现峰，而ct值也分别只有15、25左右？
2.        我以5倍浓度的梯度稀释，为什么ct值会相差10左右？
3.        忽略掉最低两个浓度后的标准曲线slope：-12.24，Y-inter：55.271，R2：0.998，EFF%：17.551，这正常吗？
诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下
标准曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-1
最后两个浓度去掉以后的标曲.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-2
625倍浓度（最高浓度）的扩增曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-3
125倍浓度的扩增曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-4
25倍浓度的扩增曲线.png


诡异的qPCR结果，请大家帮忙解释下-5
5倍浓度的扩增曲线.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-03 04:41:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沙门小rna

金虫 (正式写手)
扩增效率怎么那么低呢。你体系有问题啊。ct一般18-30之间比较好。太高太低都不行。效率最好是100%但是不可能达到。但是17%太低了。刚开始就达到峰值我估摸是你非特性扩增吧。是不是引物么有选好。建议你把产物跑一个电泳看看条带是否是你要的。~
赞一下 回复此楼
应助之星就是我~没错。你没有看错~
3楼2013-11-05 14:42:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

匿名

用户注销 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jbj1001: 金币+10, ★有帮助 2013-11-05 00:15:34
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2013-11-05 00:13:13
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

jbj1001

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-05 14:42:41
扩增效率怎么那么低呢。你体系有问题啊。ct一般18-30之间比较好。太高太低都不行。效率最好是100%但是不可能达到。但是17%太低了。刚开始就达到峰值我估摸是你非特性扩增吧。是不是引物么有选好。建议你把产物跑一个 ...

产物没有跑电泳，但是溶解曲线是单峰。换了牛细胞的样品做的GAPDH标准曲线很好。这个是小鼠的GAPDH，还做了小鼠的另外一个基因的，也是和这个一样的。
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-07 10:03:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沙门小rna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jbj1001 at 2013-11-07 10:03:11
产物没有跑电泳，但是溶解曲线是单峰。换了牛细胞的样品做的GAPDH标准曲线很好。这个是小鼠的GAPDH，还做了小鼠的另外一个基因的，也是和这个一样的。...

首先无语的结果
然后。。。。。光从现象上解释就是你一开始就有很强的荧光强度，感觉后面ct阈值相似了。是不是样本没冰上弄啊？还是什么别的原因，光看图分析是无解。
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

jbj1001
应助之星就是我~没错。你没有看错~
5楼2013-11-07 10:33:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +5 Liwangman 2026-03-15 5/250 2026-03-16 17:10 by 我的船我的海
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +12 不知道叫什么！ 2026-03-15 14/700 2026-03-16 16:45 by 我的船我的海
[考研] 0856求调剂 +3 刘梦微 2026-03-15 3/150 2026-03-16 10:00 by houyaoxu
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +5 薛云鹏 2026-03-15 5/250 2026-03-15 20:38 by Logic2024
[考研] 265求调剂 +4 威化饼07 2026-03-12 4/200 2026-03-14 17:23 by userper
[考研] 复试调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-14 3/150 2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 一志愿哈工大材料324分求调剂 +5 闫旭东 2026-03-14 5/250 2026-03-14 14:53 by 木瓜膏
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-10 11/550 2026-03-14 12:18 by 邱gl
[考研] 311求调剂 +5 牛乳糖的卡卡 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:05 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工求调剂一志愿 985 总分 295 +8 dream…… 2026-03-12 8/400 2026-03-13 22:17 by 星空星月
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[考研] 【考研调剂求收留】 +3 Ceciilia 2026-03-11 3/150 2026-03-13 20:18 by JourneyLucky
[考研] 材料工程调剂 +4 咪咪空空 2026-03-11 4/200 2026-03-13 19:57 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕350 求调剂 +4 王金科 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:02 by ruiyingmiao
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 070303一志愿西北大学学硕310找调剂 +3 d如愿上岸 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:43 by houyaoxu
[考研] 420求调剂 +4 莫向外求11 2026-03-10 6/300 2026-03-12 14:41 by ruiyingmiao
[考研] 收调剂 +7 调剂的考研学生 2026-03-10 7/350 2026-03-10 17:57 by 麦茶汤圆
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭