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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 看看咱这个电泳图，菜鸟根本不懂。。
汕头大学海洋科学接受调剂
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zhouyangjue

银虫 (小有名气)

[求助] 看看咱这个电泳图，菜鸟根本不懂。。

普通凝胶电泳图，三个2000的mark，目的片段630左右，用的PCR引物GC-341f和907r，PCR条件为
94 ℃预变性 5min；接下来是 94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃延伸 10 min，最后 4 ℃保温。
PCR体系为50ul。引物浓度为0.4umol/L。其他的酶、dNTP、和镁离子都是买的混合好的。大家帮我看下我这个是怎么回事，我接下来想做DGGE。
问题1：这个电泳图胶有没有问题，出现这个样子是什么原因啊。
问题2：目的条带位置是对的，想知道后面那些东西是什么？
问题3：接下来是要做DGGE的，这样有没有影响，是否需要重新进行PCR，重新进行的话应该如何调整。
希望大家可以指导我一下，师兄没有做的，独自摸索，望得到指导。问题可能有点菜，希望大家不要介意，耐心解答。
看看咱这个电泳图，菜鸟根本不懂。。
Image9.jpg
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1楼 2013-10-21 09:28:24
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-21 10:10:26
zhouyangjue: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-10-21 11:40:41
PCR电泳图很好，很正常，至于后面的那些东西我觉得不用理他，先做胶回收吧，也许做完胶回收就没有那些乱七八糟了。我们的PCR程序跟你有点不太一样，预变性温度都是95度，5min，变性是94度，1min，估计差别应该不大。
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我给不了你宝马香车，锦衣玉食，但我会用一辈子去疼你，爱你，保护你
2楼2013-10-21 09:48:18
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Les_書t

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhouyangjue: 金币+4 2013-10-21 11:52:54
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-23 16:09:00
zhouyangjue: 金币+4 2013-10-30 11:39:53
不能说帮助，只能是说尽我所能帮你看看~
问题一、就结果而言，这个电泳图没有问题，因为你要的结果出来了630，你的目的条带很明显，出现这个样子的原因包括很多。结合问题二，原因可能是循环数过高，退火温度可能有点低，模板和引物的配比可能有点高等，详情可以搜索PCR扩增出现非特异性条带（杂带）的原因。
问题二、目的条带位置对的，后面的阴影是非特异性目的条带，也就是所谓的杂带。后面那个白色的拖带不是太影响。
问题三、就目的而言，可以做DGGE，但是可能效果不好，因为杂带的影响。会导致结果误差。建议优化下PCR实验条件，使得干菜那个图只有清晰的特异性条带，没有杂带和二聚体等其他的影响因素。这样做DGGE效果会最好。而且很容易得出你需要的实验结论。否则效果不好判别。
希望对你有帮助……
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Hey，Jude！
3楼2013-10-21 11:12:53
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zhouyangjue

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 黑盖儿 at 2013-10-21 09:48:18
PCR电泳图很好，很正常，至于后面的那些东西我觉得不用理他，先做胶回收吧，也许做完胶回收就没有那些乱七八糟了。我们的PCR程序跟你有点不太一样，预变性温度都是95度，5min，变性是94度，1min，估计差别应该不大。

切胶回收之后接着做DGGE么？只是不知道这个东西的影响啊
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4楼2013-10-21 11:13:13
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zhouyangjue

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Les_書t at 2013-10-21 11:12:53
不能说帮助，只能是说尽我所能帮你看看~
问题一、就结果而言，这个电泳图没有问题，因为你要的结果出来了630，你的目的条带很明显，出现这个样子的原因包括很多。结合问题二，原因可能是循环数过高，退火温度可能有 ...

做DGGE效果不好是什么意思？是测序测不出来还是DGGE就不能成啊，我这个PCR条件优化从哪里着手？像楼上说的切胶回收之后做DGGE可以么？
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5楼2013-10-21 11:55:45
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Les_書t at 2013-10-21 11:12:53
不能说帮助，只能是说尽我所能帮你看看~
问题一、就结果而言，这个电泳图没有问题，因为你要的结果出来了630，你的目的条带很明显，出现这个样子的原因包括很多。结合问题二，原因可能是循环数过高，退火温度可能有 ...

我的意思是说，你做一下胶回收看看能不能把那些杂质去掉，我没有做过DGGE，不过从网上的描述来看，DGGE的结果受影响的因素比较多，不仅仅是DNA的问题，再重复几次试试吧。还有，降低一下循环数吧，时间太长了也容易扩增出非特异性片段。
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我给不了你宝马香车，锦衣玉食，但我会用一辈子去疼你，爱你，保护你
6楼2013-10-21 14:37:13
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西苑前

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-10-21 17:59:05
zhouyangjue: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 11:41:23
目的条带很亮啊，而且大小也基本正确，电泳结果是没问题的，后面的一些拖尾应该是 非特异性扩增的条带，毕竟你的退火温度才50度，你要是觉得这样的结果不太好，可以把退火温度提升到56度，看看效果会不会好些
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7楼2013-10-21 17:21:32
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece
引用回帖:
7楼: Originally posted by 西苑前 at 2013-10-21 17:21:32
目的条带很亮啊，而且大小也基本正确，电泳结果是没问题的，后面的一些拖尾应该是 非特异性扩增的条带，毕竟你的退火温度才50度，你要是觉得这样的结果不太好，可以把退火温度提升到56度，看看效果会不会好些

我也觉得退火温度可以高点，但是最好根据引物GC量确定！
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有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！
8楼2013-10-21 18:22:15
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhouyangjue at 2013-10-21 11:55:45
做DGGE效果不好是什么意思？是测序测不出来还是DGGE就不能成啊，我这个PCR条件优化从哪里着手？像楼上说的切胶回收之后做DGGE可以么？...

利用DGGE可以分离长度只有200~700bp的DNA片段，若长度超过700bp会造成检定效率的下降，后面的拖尾带可能会有影响！
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有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！
9楼2013-10-21 18:24:45
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-23 16:09:09
zhouyangjue: 金币+1 2013-10-30 11:41:29
目标条带很亮，说明扩增效率很高，完全可以提高退货温度，去除一些非特异扩增；还可以纯化PCR产物，降低非特异扩增产物量，以减少影响~
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10楼2013-10-22 13:31:43
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