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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » MTT实验求助
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steellyc

新虫 (小有名气)

[求助] MTT实验求助 已有1人参与

我是个细胞菜鸟，最近准备尝试做细胞实验，关于MTT有些问题不太明白，请不吝赐教。
先大概介绍一下研究目的：已知某因子可促进某细胞增殖，也有报道该因子可激活MAPK，那么我想采用MAPK拮抗剂来验证一下该因子刺激细胞增殖的作用是否与MAPK有关。MTT实验中我不明白的有：
1、该因子是否需要做浓度梯度和时间梯度？还是采用多浓度1个时间点，或是1个浓度多个时间点？
2、如果是浓度和时间都做梯度的话，那MAPK抑制剂全都要加吗？那样的话感觉内容很混乱。是不是应该先选出一个最佳浓度和最佳作用时间，在这个条件下观察抑制剂的作用？
3、加MAPK抑制剂应该是在加该因子之前把，那应该提前多久加呢？30 min？ 1 h？
4、加该因子前，需要把抑制剂吸出来吗？
5、只做MTT实验能否说明我的研究目的？有没有必要再检测该因子作用后细胞中MAPK的活性或表达变化？
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1楼 2013-09-29 00:08:24
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whiteblue

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.能够抑制MAPK，又不影响细胞活力的抑制剂的浓度确定好
2.一般抑制剂都是在加药1h前添加
3.如果我做的话，会这样设计：因子-抑制剂-；因子+抑制剂-；因子+抑制剂-；因子+抑制剂+
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2楼2013-09-29 14:55:56
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.总的来说，先要筛选出因子和MAPK抑制剂的最佳使用浓度。对于因子来说是找出最大有效浓度，对于抑制剂是确定其对细胞毒性最小的浓度。
2.确定因子和抑制剂的最佳浓度以后，才能确定最佳作用时间。
3.抑制剂必然要先于因子加入，除去抑制剂以后，直接加入因子就行。
4.MTT只能说明细胞的分化能力，如果想进一步研究，需要设计其他实验
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3楼2013-09-29 16:17:17
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steellyc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by feilinshiji at 2013-09-29 16:17:17
1.总的来说，先要筛选出因子和MAPK抑制剂的最佳使用浓度。对于因子来说是找出最大有效浓度，对于抑制剂是确定其对细胞毒性最小的浓度。
2.确定因子和抑制剂的最佳浓度以后，才能确定最佳作用时间。
3.抑制剂必然要 ...

谢谢回复!还有一丝不解。
1，是不是说要先筛选出最佳浓度，再优化最佳时间，然后在最佳浓度和最佳时间的条件下，观察抑制剂对因子作用的影响？
2，最佳浓度是指半最大效应浓度吗？最佳时间是指最佳浓度在什么时间点效应最大吗？
3，您的意思是加抑制剂作用1 h后，吸出来，然后再加因子是吗？必须要去除抑制剂吗？
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4楼2013-10-01 03:43:12
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by steellyc at 2013-10-01 03:43:12
谢谢回复!还有一丝不解。
1，是不是说要先筛选出最佳浓度，再优化最佳时间，然后在最佳浓度和最佳时间的条件下，观察抑制剂对因子作用的影响？
2，最佳浓度是指半最大效应浓度吗？最佳时间是指最佳浓度在什么时间 ...

你的理解完全正确
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5楼2013-10-01 09:55:48
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09四叶草

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

MTT只是测量药物对细胞活力的指标，我们实验室这方面做很多，首先你要用MTT测一下这种因子对细胞增殖的影响，尽管人家做过了你也要做一下。一般都是测12h、24h细胞的活力，MAPK肯定得刷出最适合的浓度，然后时间梯度一般选用24h，而关于加抑制剂的时间你应该查阅相关文献，这就比较专业啦。MTT不能说明你研究的目的，只算是实验的一个验证性的一部分，具体的还有后续测量相关蛋白的表达。我也是菜鸟，加油呀
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6楼2014-12-27 14:59:31
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