应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » 求助HPLC方法
61/1返回列表
查看: 930  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kxq19891208

金虫 (正式写手)

[求助] 求助HPLC方法

化合物的方法怎么设定，有大众方法吗？
例如邻二萘酚。谢谢。以前上班看到分析是根据化合物极性来设定，谢谢大家了。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
生命不息，奋斗不止
1楼 2013-09-28 13:41:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kk-kk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
release53: 金币+1, 辛苦了 2013-09-29 09:08:34
可以设置梯度洗脱。正相的柱子可以用正己烷：异丙醇，反相的柱子可以用水：甲醇。手性化合物就根据你要测的化合物结果选用AD、OJ、OD等分离。 具体的梯度洗脱设置方法是 单击泵，选择插入，在时间0min,浓度为0%；60min,浓度为50%就可以了。一般一个小时内就出峰了。
赞一下 回复此楼
有理想的活着！
2楼2013-09-28 15:13:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifucheng

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kxq19891208: 金币+20 2013-09-29 21:13:55
邻二萘酚 含芳香结构 波长254nm 流动相甲醇-水（60:40） 柱温40度 流速1.0ml\min 进样体积10微升 C18柱子就行了 估计保留时间有点长 在10min左右吧
赞一下 回复此楼
3楼2013-09-28 15:23:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kxq19891208

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lifucheng at 2013-09-27 19:23:07
邻二萘酚 含芳香结构 波长254nm 流动相甲醇-水（60:40） 柱温40度 流速1.0ml\min 进样体积10微升 C18柱子就行了 估计保留时间有点长 在10min左右吧

别的化合物呢
回复此楼
生命不息，奋斗不止
4楼2013-09-28 18:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tianxia119wo

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kxq19891208: 金币+10 2013-09-29 21:13:47
我整理了仪器信息网的一个帖子，希望对你有用。转帖（http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20090404/1821143/）
1 文献查阅
   文献报道的测定该化合物的主要方法是液相色谱-紫外检测，只有一篇是液质联用的方法，考虑到这个项目样品多（2000多个），测定周期长和成本等，领导决定让我用液相来测定。
查阅文献，我们可以从中获得一些基本的信息，如色谱柱类型、流动相性质、检测波长、前处理方法等。根据自己实验的要求，可能还要关注一下最低定量限、检测时间的长短等等信息。必要时可以做点笔记，把最关心的信息记录下来。

根据文献获得的主要信息：
1）色谱柱：均为C18，长度有150mm，200mm，250mm，内径和粒径分别为4.6mm和5μm；
2）流动相：有机相是甲醇或乙腈，水相多为磷酸和磷酸盐缓冲溶液，pH值3～4；
3）检测波长：225nm或者275nm；
4）前处理方法：沉淀或者提取；
5）最低定量限：0.2 μg/mL。；分析时间（液相）：13min左右。

2 仪器的选择
    很多时候，仪器是没的选的，如果有条件的话，可以选择性能稳定的、操作方便的或者自己比较熟悉的仪器。当然还可以根据仪器一些自身的特点来选择，比如：如果流动相里面既有甲醇还有乙腈，尽量避免用Waters的，单向阀比较容易出问题；如果要跑梯度，尽量选择是高压混合的。

3 色谱条件的建立
    这是过程可能很短很简单，也可能很漫长很费事，关键和很多因素有关，如化合物的性质、实验室现有的条件、成本、检测对灵敏度的要求等等，总之，就是要在满足检测要求的前提下，分析测试时间越短、成本越低、操作越简单越好。

1）检测波长的选择
    文献报道的检测波长有225nm和275nm。一般说来（也有化合物例外），化合物在低波长段信号响应会好些，但是干扰也多，随着波长的增加，干扰会逐渐降低。不确定这两种波长的响应究竟差多少，我就拿紫外扫描了一下，的确225nm左右有最大吸收，而275nm处吸收太低，不可能满足我检测的要求，所以选择225nm作为我的检测波长。
    很希望275nm处有强的紫外吸收，这样就算比225nm处稍微响应低些，但是干扰少，基线平，色谱条件建立起来容易啊，可惜……
2）色谱柱、流动相和内标的初步选择
    选择色谱柱主要是参考文献和实验室现有色谱柱的情况， C18柱（ODS柱）适合大多数非极性样品的分析，如果样品极性大，可以选择氨基柱、腈基柱和HILIC柱等，也可以选择正相系统。只是从反相系统向正相系统过渡的时候要注意，不然会引起整个系统的堵塞。
    我需要测定的物质A极性不大，文献报道基本都是C18柱，所以就用我们实验室最常用、储备也比较多的几根柱子开始摸条件，如Waters Symmetry C18，Agilent ZORBAX SB C18等（当然也是考虑了流动相的性质）。
    流动相考虑到成本和毒性，决定先试甲醇，水相就参考文献配了25mmol/L的KH2PO4溶液（pH3.0）。
内标先试用了实验室现有的化合物，但是均与A的保留时间差的比较大，且相对靠前（血浆样品容易有干扰）。后来选用了文献报道的化合物B，出峰在A的后面，干扰少。
    总共比较了Waters Symmetry C18(4.6×150mm, 5μm) 、Waters Symmetry C18(4.6×75mm, 3.5μm)和Agilent ZORBAX SB C18(4.6×150mm, 5μm)三根柱子，最后选择了第二根色谱柱（尽管没有文献报道是用这么短的柱子的），原因是：
    1. Waters的这两根柱子都是Symmetry C18的，差别是长度和粒径，短柱子样品出峰快，样品与内标分离效果好，但是就是柱压高些。
当用150mm的柱子进样，甲醇:水相＝72:28(v:v)，1ml/min, 225nm, 柱温35℃时，样品A的保留时间是tR=8.2min，内标B的保留时间tR=14min左右。这样的进样时间对于我来说太长了， 2300多个样品，保留时间的长短直接影响到我的进样时间，我希望保留时间再短些，这就意味着有机相的比例还要增加，但是由于水相有盐，有机相太高怕析出，而且成本也会增加，所以就选择了短柱。
    2. Agilent的柱子样品和内标的分离效果没有远没有Waters的好，如果要分开，那么两者的保留时间又会大于10min，但是柱压明显比Waters的低。

3）色谱条件的优化及前处理方法的选择
我的原则就是前处理越简单越好，分析时间越短越好，分析成本越低越好。
1．先拿样品及内标的对照品来初步确定色谱条件
当然这只是初步看一下，看看标准品进样，灵敏度怎样，是否需要浓缩样品，内标和样品峰分的怎么样等等。

2．根据检测要求选择最方便的前处理方法
根据我的检测要求，LLOQ最少要做到500ng/mL，当然能低更好。看看我的灵敏度，用蛋白沉淀法应该没有问题，当然前提是没有内源性干扰。于是试了几种最常用的沉淀剂：甲醇、乙腈和甲醇硫酸锌。
一般三者加的量是甲醇硫酸锌最少、乙腈次之、甲醇最多，当然是为了保证蛋白能充分沉淀。加的沉淀剂越少，样品稀释就越少，可能就会有更高的灵敏度。
结果，硫酸锌沉淀响应最好，峰也窄，而甲醇和乙腈沉淀样品峰响应相差不大，但乙腈沉淀峰更宽些，因此先选择用甲醇硫酸锌沉淀。

3．优化色谱条件
确定好了色谱柱、流动相、内标和前处理方法，下面就是要正式开始优化条件了，有干扰的避干扰，能缩短分析时间就缩短分析时间。
1）首先调节流动相比例、柱温，使得样品峰和内标能够分开，且总的分析时间在10min以内。
2）做空白血浆加标的样品，看有无干扰。果然，不出所料，样品峰和内标处均有干扰，继续优化流动相比例、柱温、流速等参数，样品峰处基本无干扰了，但是干扰峰始终在内标峰出徘徊。
3）下面开始了排除血浆干扰的优化工作。
A．走梯度：甲醇走梯度，基线波动太大，有机相换成乙腈，样品峰响应下降，峰变宽，也不合适，失败。
最后，做个小结，也算对用HPLC做生物样品分析（血浆、尿、组织等）的版友介绍一下我的个人体会，供大家参考：

1 首先就是要查阅相关资料，如文献等，了解你要测化合物的性质，根据文献来选择你的初始条件。比如色谱柱、流动相、前处理方法，还有检测器等等。
2 了解液相的基本原理和基本操作，这是你做好液相、用好液相的前提。比如什么样品可以用反相、什么样品用正相系统来检测，反相系统加大有机相的比例峰会怎么变化；柱温、流动相pH值、溶剂对你的样品峰会有什么影响；遇到一些简单的仪器问题怎么处理、一些仪器参数是什么意思、对你的样品峰有什么影响等等，当然这些是慢慢学习的过程，学的越多，你会发现你建立方法用的时间越短、走的弯路越少。当然，我也在慢慢的学习中。
3 知道各种前处理方法及其优缺点，比如沉淀剂的种类、加入的比例，适合的化合物性质。常用的提取溶剂有哪些，适合提取的化合物的极性等。
4 要预先估计你所需要的LLOQ，根据这个LLOQ来优化你的色谱条件。比如灵敏度足够，可以用沉淀，不够可以用提取，提取浓缩的比例根据LLOQ来定。当然还可以其他的辅助手段，比如加大进样量、用梯度洗脱的方式等等。
5 做液相可能最头疼的就是干扰，用紫外检测器特别是在低的检测波长段，可以说是杂草丛生，所以一般分析时间都比较长。改用提取后，可能会好些。如果可以，宁愿牺牲一些灵敏度而选择相对高一些的检测波长。荧光检测，干扰就很少。多试不同来源的空白基质，确保没有干扰。有条件，也像我这样，买来的空白血浆和受试者的空白最好也试一下，以免不同（这样的情况非常非常少见）。

先写这么多，比较乱，有空再来上点图谱。其中有写的不当的地方，请大家批评指正。
赞一下 回复此楼
浙大化学系本科生,希望能和各位虫友多多交流,互相帮助.
5楼2013-09-29 10:00:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘东磊

金虫 (小有名气)
没有什么通用的方法，一般根据化合物的性质来确定，流动相的选择很重要。大体现确定，然后在微调。
赞一下 回复此楼
6楼2013-09-29 11:29:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kxq19891208 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭